• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제17권11호
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• pp.1751-1757
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• 2007

Elastin-like polypeptides (ELPs) undergo a reversible inverse phase transition upon a change in temperature. This thermally triggered phase transition allows for a simple and rapid means of purifying a fusion protein. Recovery of ELPs-tagged fusion protein was easily achieved by aggregation, triggered either by raising temperature or by adding salt. In this study, levansucrase has been used as a model enzyme in the development of a simple one-step purification method using ELPs. The levansucrase gene cloned from Pseudomonas aurantiaca S-4380 was tagged with various sizes of ELPs to functionally express and optimize the purification of levansucrase. One of two ELPs, ELP[V-20] or ELP[V-40], was fused at the C-terminus of the levansucrase gene. A levansucrase-ELP fusion protein was expressed in Escherichia coli $DH5{\alpha}$ at $37^{\circ}C$ for 18 h. The molecular masses of levansucrase-ELP[V-20] and levansucrase-ELP[V-40] were determined as 56 kDa and 65 kDa, respectively. The phase transition of levansucrase-ELP[V-20] occurred at $20^{\circ}C$ in 50 mM Tris-Cl (pH 8) buffer with 3 M NaCl added, whereas the phase transition temperature ($T_t$) of levansucrase-ELP[V-40] was $17^{\circ}C$ with 2 M NaCl. Levansucrase was successfully purified using the phase transition characteristics of ELPs, with a recovery yield of higher than 80%, as verified by SDS-PAGE. The specific activity was measured spectrophotometrically to be 173 U/mg and 171 U/mg for levansucrase-ELP[V-20] and levansucrase-ELP[V-40], respectively, implying that the ELP-tagging system provides an efficient one-step separation method for protein purification.

• Bulletin of the Korean Chemical Society
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• 제31권9호
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• pp.2493-2496
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• 2010

Erythropoietin (EPO) is mainly produced in kidney and stimulates erythropoiesis. The use of recombinant EPOs for doping is prohibited because of its performance enhancing effect. This study investigated whether biosimilar EPOs could be differentiated from endogenous one by iso-electro-focusing plus double blotting and SDS-PAGE for antidoping analysis. The established method was validated with positive control urine. The band patterns were reproducible and meet the criteria, which was made by world anti doping agency (WADA). Isoelectric focusing was conducted in pH range 2 to 6. Recormon (La Roche), Aropotin (Kunwha), Epokine (CJ Pharm Co.), Eporon (Dong-A), Espogen (LG Life Sciences), and Dynepo (Shire Pharmaceuticals) were detected in basic region. All biosimilars showed discriminative isoelectric profiles from endogenous EPO profiles, but they showed different band patterns with the reference one except Epokine (CJ Pharm Co.). Next, SDS-PAGE of biosimilar EPOs resulted in different molecular weight patterns which were distributed higher than endogenous EPO. Commercial immune assay kit as an immune affinity purification tool and immobilized antibody coated magnetic bead were tested for the purification and concentration of EPO from urinary matrix. The antibody-coated magnetic bead gave better purification yield. The IEF plus double blotting and SDS-PAGE with immunoaffinity purification method established can be used to discriminate biosimilar EPOs from endogenous EPO.

• 한국지반환경공학회 논문집
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• 제9권4호
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• pp.77-84
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• 2008

토양정화법은 하 오수 및 폐수정화를 위하여 호기성 미생물이나 혐기성 미생물 같은 토양미생물을 활용하여 하 오수 및 폐수를 정화하는 공법으로, 흙 속에 있는 토양 미생물은 종류가 다양하여 주변 환경 변화에 따른 미생물의 증식이 가능하다. 따라서 토양정화법은 타 공법과는 달리 유입수의 부하변동에도 적절하게 대응할 수 있으며, 특별한 유지관리기술이 불필요한 공법으로 T-N, T-P등을 함께 처리할 수 있다. 또한, 상부에 개량된 토양을 피복하고 그 위에 잔디 등 식물을 식재함으로써 악취를 제거하고, 휴식공간으로도 이용이 가능하다. 본 연구에서는 토양정화법이 적용된 현장의 유입수와 유출수의 수질을 비교하여 토양정화법의 오염물질의 처리 과정과 능력을 분석하였다. 그 결과 BOD, COD, SS, 대장균 수의 처리효율은 약 90~100%로 나타났으며, T-N, T-P의 처리효율은 60~80%로 나타났으며, 유출수의 수질은 하수종말 처리시설 방류수 수질기준을 만족하였다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제11권
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• pp.63-66
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• 1969

본(本) 실험(實驗)은 Bacillus subtilis계(系)의 균주(菌株)가 생성(生成)하는 Protease를 Tannin을 사용(使用)하여 Complex를 형성(形成)시켜 이 비용성(非溶性) Complex를 회수(回收)하여 Tannin을 분리(分離)함으로써 효소(酵素)를 유기(有機) 용매중(溶媒中)에서 회수(回收)하는 방법(方法)을 확인(確認)한 것이며 Proteeas-Tannin Complex형성(形成)에 미치는 pH, 온도(溫度), 시간(時間) 등(等)의 영향(影響)을 조사(調査) 하였다. 그 결과(結果)는 Complex형성(形成)에 있어서 1. 최적(最適) pH는 6.0이었으며 2. 온도(溫度)의 범위(範圍)는 $40^{\circ}C$까지 별(別) 영향(影響)이 없었으며 3. Complex형성(形成) 시간(時間)은 30분간(分間)이 가장 적당(適當)하였으며 4. 효소(酵素) 농도(濃度)는 영향(影響)을 미치지 않았으며 5. 무기(無機) 염류중(鹽類中) $CaCl_2$와 NaCl의 존재(存在)는 Complex형성(形成)에 영향(影響)을 미처 결과적(結果的)으로 효소(酵素)의 회수율(回收率)을 저하(低下)시킨다는 결과(結果)를 얻었다.

• Entomological Research
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• 제48권6호
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• pp.533-539
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• 2018

The RNA interference (RNAi) has been considered as an important genetic tool and applied to develop a new living modified (LM) crop trait which is an improvement of nutrient quality or pest management. The RNAi of DvSnf7 has been used for resistance to LM maize and the Western Corn Rootworm which is a major agricultural pest for the US Corn Belt. Most of the environmental risk assessments (ERA) of double strand RNA (dsRNA) have been performed using in vitro transcript products, and not in vivo expressed product. A large amount of dsRNA was required for the acute toxicity assay of water fleas. Therefore development of massive dsRNA purification techniques is critical. Daphnia, a freshwater microcrustacean, is a model organism for studying cellular and molecular mechanism involved in life history traits and ecotoxicology. In this study, we established the massive dsRNA purification method using Escherichia coli and implemented acute toxicity assays to Daphnia magna. As a result, the present RNase A and DNase I, dsRNA was efficiently purified without any special techniques or equipment. Even though purified dsRNA existed during the acute toxicity test, lethality or abnormal behavior were not observed in D. magna. These results indicated that GFP and DvSnf7 dsRNA were not significantly affected to D. magna due to their lack of sequence matching in its genome. The purification method of dsRNA and the acute toxicity assay of water fleas using purified dsRNA would be suitable for the toxicological studies of LMOs to aquatic non-target organisms.

• Journal of Ginseng Research
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• 제12권2호
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• pp.164-172
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• 1988

인삼사포닌 정량분석의 상법 purification과정을 역상소형 $C_18$ 컬럼 전처리로 대체할 수 있었으며, 분석시간은 1/4로 단축되었다. 이 방법을 사용하면 total ginsenoside의 회수율은 높으나 protopanaxatriol계 ginsenoside들의 회수율은 약간 낮았으며, 근중 농도 정도의 당류는 ginsenoside 회수율에 영향을 미치지 않았다. Ginsenoside 회수율의 변이계수는 상법의 경우보다 작았으며 이 방법에 사용되는 ginsenoside의 적정량은 10~15mg이었다. 역상소형컬럼방법은 건삼과 홍삼시료처리시에도 상법과 고도의 유의성을 나타냈다. 신속 역상소형컬럼 방법을 실제로 이용하기 위하여 8점의 시료를 동시에 처리하는 소형아크릴 장치를 사용하였다.

• 한국식품과학회지
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• 제20권6호
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• pp.780-786
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• 1988

본 실험은 Staphylococcus aureus로부터 생성되는 enterotoxin A의 분리를 위하여 각종 분리방법을 조사하였고 그 특성들을 상호 비교하였던 바 다음과 같은 결과를 얻었다. Amberlite 수지는 배지로부터 처음 toxin을 분리 하는 데에는 간편한 수지이나 정제도에 있어서는 약 70%수준으로 다른 방법들에 비해 낮은 편이었다. CM-cellu-lose수지는 0.2M phosphate buffer로 용출했을 때 75% 정도의 정제도를 가진 toxin을 분리할 수 있었으나 stepwise법으로 용출했을 때에는 80% 이상으로 정제도를 높일 수 있었고 Amberlite 수지와 함께 사용했을 때에는 90%정도의 toxin을 얻을 수 있었다. Amberlite나 CM-cellulose수지로 정제한 후 gel filtration을 실시하면 정제도를 더 높일 수 있었다. FPLC는 분리도와 정제도에서 가장 우수하였으며 FPLC의 결과에 따라 Amberlite 수지는 toxin 분획을 중심으로 앞의 분획을 그리고 CM-cellulose 수지는 뒤의 분획을 주로 제거 하는 특징을 가진다. 따라서 위의 column중 하나만 사용한 후 FPLC를 사용하면 95%이상의 toxin을 분리하는 것이 가능하였다.

• 한국수산과학회지
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• 제3권1호
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• pp.27-32
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• 1970

살아 있는 개량조개 속에 들어 있는 토사의 배출에 대하여 실험한 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 토사는 주로 입수관 및 출수관 주변, 아가미 주변, mantle주변 그리고 중장선을 위시한 소화 기관 속에 존재하였다. 그리고 소화기관 속에 들어 있는 모래의 크기는 $180\times10\mu\~550\times200\mu$정도의 극히 작은 것들이었다. 2) 시료를 밑바닥에 깔아 놓은 것과 중간층에 수하시킨 것 그리고 단층으로 깔든지 또는 수하시킨 것과 두껍게 깔든지 또는 수하시킨 것 사이에 토사의 배출에 있어 뚜렷한 차이는 찾아 볼 수 없었다. 3) 개량조개는 처음 1시간 정화시키면 약 $50\%$의 토사를 배출하며, $22\~26$ 시간만에 배출물의 양이 거의 일정한 값에 도달하지만, 배출물 속에 토사가 배출되지 않을 때까지는 약 42시간 소요되었다. 4) 토사의 배출에 미치는 PH의 영향을 보면 개량조개가 살고 있는 환경 해수보다 약 1정도 높은 쪽(pH 8.75)이 빨랐다. 5) 토사의 배출에 미치는 온도의 영향은 개량조개가 살고 있는 환경 해수의 온도 때가 온도를 더 높였을 때보다 토사의 배출이 빨랐다. 6) 토사의 배출에 미치는 염분 농도의 영향은 개량조개가 살고 있는 환경 해수의 염분 농도($30.61\%_{\circ}$)보다 약 배로 묽은 쪽($15.14\%_{\circ}$)이 배출이 빨랐다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제18권10호
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• pp.1648-1654
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• 2008

Superoxide dismutase (SOD) removes damaging reactive oxygen species from the cellular environment by catalyzing the dismutation of two superoxide radicals to hydrogen peroxide and oxygen. Extracellular superoxide dismutase (EC-SOD) is a tetramer and is present in the extracellular space and to a lesser extent in the extracellular fluids. Increasing therapeutic applications for recombinant human extracellular superoxide dismutase (rEC-SOD) has broadened interest in optimizing methods for its purification, with a native conformation of tetramer. We describe a solid phase refolding procedure that combines immobilized metal affinity chromatography (IMAC) and gel filtration chromatography in the purification of rEC-SOD from Escherichia coli. The purified rEC-SOD tetramer from the $Ni^{2+}$-column chromatography is refolded in Tris buffer. This method yields greater than 90% of the tetramer form. Greater than 99% purity is achieved with further purification over a Superose 12PC 3.2/30 column to obtain the tetramer and specific activities as determined via DCFHDA assay. The improved yield of rEC-SOD in a simple chromatographic purification procedure promises to enhance the development and therapeutic application of this biologically potent molecule.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제19권7호
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• pp.727-733
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• 2009

Heat shock protein 70 kDa (hsp70), a molecular chaperone involved in folding of nascent proteins, has been studied for its ability to activate innate and specific immunity. High purity hsp70 preparation is generally required for immunization experiments, because endotoxins and other immunologically active contaminants may affect immune responses independently of hsp70. We have developed a novel modification of E. coli-expression medium that enabled a simple two-step production and purification method for endotoxin-free recombinant hsp70. During Ni-NTA-based affinity purification of hsp70, a contaminating protein from host E. coli cells, L-glutamine-n-fructose-6-phosphate aminotransferase (GFAT), was identified. By testing various compounds, supplementation of growth medium with a GFAT metabolite,N-acetylglucosamine, was found to reduce GFAT expression and increase the total hsp70 yield five times. The new protocol is based on column purification of His-tagged hsp70 protein produced by E. coli with the modified medium, followed by endotoxin removal by Triton X-114 extraction. This approach yielded hsp70 with high purity and minimal endotoxin contamination, making the final product acceptable for immunization experiments. In summary, a simple modification of growth medium allowed production of recombinant mouse hsp70 in high yield and purity, thus compatible with immunological studies. This protocol may be useful for production of other Histagged proteins expressed in E. coli.