• 생명과학회지
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• 제13권2호
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• pp.143-149
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• 2003

This experiment was undertaken to investigate proper conditions for protoplast isolation and regeneration from the mycelia of Lyophyllum ulmnrium. Protoplast isolation and regeneration are influenced by a variety of factors such as enzyme, osmotic stabilizer, reaction time and age of mycelia. A combination of Novozyme 234 (10mg/ml) and cellulase Onozuka R-10 (10 mg/ml) with 0.6 M $MgSO_4$ was most effective for isolation of the protoplasts. The optimum reaction time of the mycelia with the lytic enzymes was 3.5~4 hours at $28^{\circ}C$ in shaking condition at 120 strokes per min. High yield of the protoplasts were obtained from its 4~5 days old mycelia on complete agar media. Its protoplasts were regenerated to normal hyphae. Regeneration media with 0.6 M sucrose were proper for regeneration of the protoplasts. Their regeneration frequency on complete agar media was 2.3~2.7%.

• 한국해양바이오학회지
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• 제12권1호
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• pp.50-58
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• 2020

Sphacelaria is a filamentous brown algal genus that can be epibiotic on macroalgae, marine plants, and sea turtles. Its important role in benthic ecosystems, exposure to different stressors (e.g., grazing), and use as a model organism make Sphacelaria ideal for assessing physiological responses of organisms to environmental inputs. Single-cell RNA sequencing is a powerful new probe for understanding environmental responses of organisms at the molecular (transcriptome) level, capable of delineating gene regulation in different cell types. In the case of plants, this technique requires protoplasts ("naked" plant cells). The existing protoplast isolation protocols for Sphacelaria use non-commercial enzymes and are low-yielding. This study is the first to report the production of protoplasts from Sphacelaria fusca (Hudson) S.F. Gray, using a combination of commercial enzymes, chelation, and osmolarity treatment. A simple combination of commercial enzymes (cellulase Onozuka RS, alginate lyase, and driselase) with chelation pretreatment and an increased osmolarity (2512 mOsm/L H₂O) gave a protoplast yield of 15.08 ± 5.31 × 10⁴ protoplasts/g fresh weight, with all the Sphacelaria cell types represented. Driselase had no crucial effect on the protoplast isolation. However, the increased osmolarity had a highly significant and positive effect on the protoplast isolation, and chelation pretreatment was essential for optimal protoplast yield. The protocol represents a significant step forward for studies on Sphacelaria by efficiently generating protoplasts suitable for cellular studies, including single-cell RNA sequencing and expression profiling.

• 식물조직배양학회지
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• 제25권5호
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• pp.335-339
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• 1998

미숙배주조직 유래의 배발생캘러스를 이용하여 원형질체의 유리 및 배양에 미치는 요인을 조사하였다. 배발생캘러스로부터 원형질체를 유리시키는데 적당한 배양시간은 16시간이었고, 건전한 원형질체를 유리하는데 적당한 효소용액의 농도는 0.7M $\textrm{BH}_{3}$ 용액과 cellulase 1.0%, macerozyme 1.0%, pctolyase 0.2%가 혼합된 효소용액을 동량으로 조합하였을 때가 가장 효과적이었다. 유리된 원형질체는 MT기본배지에 0.1 mg/L 2,4-D를 첨가한 배지로 배양하면 캘러스 형성이 양호하였다. 유도된 캘러스는 고체배지에 계대배양하고 있으나 생육이 징약한 상태이다. 본 실험결과 배발생캘러스유래의 원형질체와 엽육세포유래의 원형질체 융합에 의한 배양도 가능할 것으로 생각되었다.

• Plant Biotechnology Reports
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• 제2권3호
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• pp.171-177
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• 2008

This paper reports an improved protocol for isolation, culture and regeneration of Lotus corniculatus protoplasts. A range of parameters which influence the isolation of L. corniculatus protoplasts were investigated, i.e., enzyme combination, tissue type, incubation period and osmolarity level. Of three enzyme combinations tested, the highest yield of viable protoplasts was achieved with the combination of 2% Cellulase Onozuka RS, 1% Macerozyme R-10, 0.5% Driselase and 0.2% Pectolyase. The use of etiolated cotyledon tissue as a source for protoplast isolation proved vital in obtaining substantially higher protoplast yields than previously reported. Culture of the protoplasts on a nitrocellulose membrane with a Lolium perenne feeder-layer on the sequential series of PEL medium was highly successful in the formation of microcolonies with plating efficiencies 3-10 times greater than previous studies. Shoot regeneration and intact plants were achieved from 46% of protoplast-derived cell colonies.

• 미생물학회지
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• 제22권4호
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• pp.207-214
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• 1984

2-deoxy-D-glucose가 첨가된(25 pg/ml) 최소액체 배지에 8.5시간 전 배양하여 swelling 시킨 conidiospore에 2% driselase와 2% ${\beta}-glucuronidase$를 동량 혼합한 효소용액을 처리하여 반응시킨 결과 protoplast형성 시간 2시간이내로 단축 시킬 수 있었다. 5% Ficoll(m.w. 400,000)용액을 사용하여 conidial protoplast를 보다 순수하게 분리 벙제할 수 있었으며, protoplast를 Giemsa로 핵 염색한 결과, 대부분의 protoplast는 하나의 핵을 갖고 있었다. 또한 전자현미경으로 관찰한 결과 conidiospore에서 유래된 protoplast는 세포벽 성분이 남아 있지 아니한 완전한 protoplast인 것으로 판명되었다. 영양요구성 돌연변이주에서 유래된 conidial protoplast의 융합률은 $3.4{\times}10^{-1}$에서 $4.9{\times}10^{-1}$수준으로 이는 mycelial protoplast의 경우보다 5-28배 가량 높은 수준의 것이었다.

• 생명과학회지
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• 제9권5호
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• pp.531-536
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• 1999

As an attempt to preserve resources in marine biological organisms, we first constructed a cDNA library from the red alga Porphyra yezoensis. The library construction method from P. yezoensis consists of three steps; those include protoplast presparation, RNA isolation, and phage library construction. Protoplast was prepared in order to remove much of the carbohydrate compounds which are characteristics of algal cell walls. Carbohydrate contamination in the purified RNA may inhibit further enzyme reactions, those carbohydrates should be removed. RNA samples prepared from protoplast still seemed to contain residual amount of carbohydrate because mRNA isolation with conventional method failed. We therefore developed a method with Poly ATtract mRNA isolation system. The constructed phage library was tested by analyzing cDNA insert in phage vector from randomly picked ten independent white plagues. All of the phages contained cDNA inserts with sizes ranging 0.5kb and 2.0kb.

• 한국작물학회지
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• 제27권2호
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• pp.147-154
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• 1982

식물원형질체를 이용하여 체세포잡종을 육성하기 기초자료를 얻고자 식물의 엽육부위, Callus에서 효과적인 원형질체의 분리, 적합한 배양조건 및 세포융합에 관한 조건을 조사한 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 배양 융합조건에 적합한 식물원형질체의 분리 방법은 여러 종류의 효소농도에 따라 다르지만 담배 및 완두엽육 원형질체분리에는 Macerozyme 0.5%, Cellulase 2.0%, KDS 0.5%, Mannitol 0.7M의 효소용액에 처리시 활성 있는 원형질체를 얻을 수 있었다. 2. 배양중인 담배 및 대두의 Callus로부터 원형질체분리는 배양기간에 따라 세포활성도가 떨어지거나 쉽게 파괴되는 현상을 보여 양호한 원형질체를 얻을 수가 없었다. 3. 원형질체의 배양은 배양배지에 Plating할 경우 세포농도에 따라 차이가 있었으며 1.0$\times$$10^4$/ml이상이어야 분열이 가능하였고 배양조건은 150Lux 12시간 광암처리후가 세포분열 및 증식이 가장 왕성하였다. 4. 세포융합은 PEG농도가 중요하며 PEG 1500 0.33M에서 CaCl_2농도가 높을수록 융합율이 증가되는 경향이었다.

• Journal of Plant Biology
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• 제29권1호
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• pp.11-18
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• 1986

Protopasts were isolated from cultured cells of potato (Solanum tuberosum L.) tuber tissue. The ability of callus formation from the culture cells was higher in cultivars Dejima and Superior than in Shimabara and Irish Cobbler on Lam's medium. Therefore, the former was used as sources for protoplast isolation. Friable calli were transferred to liquid media and cells in exponential phase were used for protoplast isolation. In both of Dejima and Superior, the yield of protoplasts was high in the enzyme solution of 2% Onozuka cellulase and 1% macerozyme. Also, viability of isolated protoplasts was very good. Thus, it seems that these protoplasts would be applicable to various aims of research.

• 한국균학회지
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• 제16권1호
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• pp.21-25
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• 1988

원형질체융합(原形質體融合)에 의한 영지(靈芝)의 육종(育種)을 위(爲)하여 기초자료를 얻고자 원형질체(原形質體)의 이출(裡出) 및 환원(還元)에 관한 실험결과(實驗結果)는 다음과 같다. 1. 원형질체이출(原形質體裡出)은 영지(靈芝)에서는 0.6M sucrose에 Novozym 234 $10mg{\cdot}ml^{-1}$를 단용(單用)하여 5시간(時間)정도 처리(處理)하고 4일간(日間) 배양(培養)한 균사체(菌絲體)를 사용(使用)하는 것이 좋았으며, G. sp.는 4일간(日間) 배양(培養)한 균사체(菌絲體)를 사용(使用)하고 0.6M sucrose에 Novozym 234와 ${\beta}-glucuronidase$를 각각 $10mg{\cdot}ml^{-1}$로 혼용(混用)하는 것이 좋았다. 2. 원형질체환원(原形質體還元)은 G. lucidum에서 0.6M sucrose를 첨가(添加)한 MCM에서 가장 양호(良好)하였으며, G. sp.에서는 0.6M sucrose를 첨가(添加)한 SCM에서 가장 효과적(效果的)이었다. 영지(靈芝)와 황지(黃芝)는 20% 이상(以上)의 무척 높은 환원률(還元率)을 보였다.

• 한국산림과학회지
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• 제73권1호
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• pp.33-42
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• 1986

현사시 (Populus alla${\times}$P. glandulosa)의 기내배양(器內培養) 엽육조직(葉肉組織)으로부터 원형질체(原形質體)의 분리(分離) 및 배양(培養)을 시험하였다. 무균(無菌)의 엽육조직(葉肉組織)을 육성(育成)하기 위한 shoot의 대량증식에는 MS기본배지에 BAP 0.4 mg/l을 첨가하였을 때 가장 증식효과가 높았으며, 원형질체(原形質體)의 분리(分離)를 위한 효소농도는 Cellulase 2%, Macerozyme 0.8%, Hemicellulase 1.2%, Driselase 2%, Pectolyase Y-23 0.05%가 가장 효과적이었다. 효소용액의 삼투압은 mannitol 0.6 M이 적합하였으며, pH는 5.6이 적절하였다. 원형질체(原形質體)의 안정성을 높이기 위하여 DTT와 MES buffer를 첨가하여 좋은 결과를 얻었다. 분리(分離)된 원형질체(原形質體)의 정제를 위해서는 부유용액(浮遊溶液)의 sucrose 농도를 0.6M로 하였을 때가 가장 적합하였으며 dextran의 첨가효과도 높았다. 본 연구의 특징은 다소 높은 농도의 효소용액을 처리하여 단시간에 원형질체(原形質體)를 분리(分離)하는 것으로서 이 방법에 의해 나출(裸出)된 원형질체(原形質體)의 배양(培養)에 있어서 반응여부를 조사한 결괴 배양 3주 후에까지도 좋은 반응을 보였다.