• 식물조직배양학회지
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• 제21권1호
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• pp.23-28
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• 1994

Nicotiana tabaccum 'Xanti', Petunia hybrida 'Blue Star' 그리고 Chrysanthemum morifolium 'Baeckwang'을 공시하여 엽조직 유래의 mesophyII protoplast(MP)와 paraveinal mesophyII protoplast (PVMP) 간의 세포 활성을 조사하기 위하여 urea 투과성을 측정하였다. 아울러 엽육 조직에서 원형질체 나출을 위한 각종 효소제를 처리하고 경과 시간별로 관찰했으며, 나출 원형질체로부터 식물체 재생을 위한 NAA와 thidiazuron의 효과를 조사하였다. Vibratome을 이용한 엽육조직 절단방법은 엽조직의 상해를 최소화하고 조직절편도 최소 50 $\mu\textrm{m}$까지 절단할 수 있기 때문에 urea 투과성 검정과 원형질체 나출을 위한 필수적인 기술이다. 세포활성에 대한 urea투과성 측정은 공시한 3종 식물의 PVMP에서 모두 Ks=2.Ox$10^{-5}$cm/sec 정도가 MP보다 높았다. 효소혼합 용액(1.5% Cellulase R-10, l% Driselase, 0.5% Macerozyme R-10, 0.05% Pectolyase)을 4-8 시간 처리하는 것이 PVMP 나출에 유효하였다. 나출 원형체로부터의 캘러스 유기와 식물체 재생에는 2 mg/L NAA + 0.01 mg/L thidiazuron 처리구에서 가장 양호하였으며 조직별로는 PVMP에서 월등한 결과를 나타내었다. 따라서 엽조직을 대상으로한 원형질체 배양에 있어서 엽록소의 함량이 많은 MP보다는 재생력이나 세포 활성이 강한 paraveinal 엽육조직 유래의 세포를 집약적으로 나출시켜 실험재료로 이용한다면 더 높은 식물체 재생률을 얻을 수 있을 것으로 사료된다.

• Archives of Pharmacal Research
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• 제15권1호
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• pp.35-40
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• 1992

S. fradiae showed the highest acetanilide p-hydroxylation activity in the tested strains. And S. fradiae was well characterized genetically, especially with respect to tylosin production. Two mutants, which lost hydroxylation, were isolated in 140 regenerated colonies from protoplasts. In restriction enzyme digesion of total DNAs, isolation of giant linear plasmid DNA and determination of antibiotic resistances to chloramphenicol, tylosin, hygromycin B and mitomycin C, any differences among mutants and a wild type strain were not detected. These facts suggest that lesion on 6, 000 Kb chromosomal DNA was responsible for the lack of p-hydroxylation activity induced by protoplast formation and regeneration.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제3권1호
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• pp.24-30
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• 1993

In order to develop a novel yeast which produces the charateristic aroma of soy sauce, a protoplast fusion between Zygosaccharomyces rouxii WFS4 and Torulopsis versatilis IAM 4993 was carried out. Auxotrophic mutants as selective markers were obtained from Zygosaccharomyces rouxii and Torulopsis versatilis by treatment of N-methyl-N -nitro-N-nitrosoguanidine. The conditions of the protoplast formation and the regeneration for fusion were examined. The protoplast fusion using polyethylene glycol 4000 led to the fusion frequency of $4~5{\times}10^{-7}\;cells/ml$. Among fusants, a fusant ST723-F31 presented the best results in terms of the aromaticity of fragrance, the growth pattern, the resistance against salt and the degree of growth according to pH. It makes easy to control the production and the balance of aroma components so that it gives a good flavor, shortens the fermentation period and, simplifies the preparation process when using a bioreactor into which fusant is immobilized.

• KSBB Journal
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• 제6권3호
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• pp.289-297
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• 1991

The insecticidal protein gene in the pKL-20-1 clone derived from Bacillus thuringiensis serovar. kurstaki plasmid was subcloned in the plant shuttle vector, pGA643. The 7.3 kb fragment was cloned in the BglII and Hpal sites of pGA643 vector and expressed in E. coli S17-1, which produced insecticidal proteins killing Bombyx mori larvae. The clone was named pHL-20. The protoplast formation, calli induction and plantlet regeneration of Nicotiana tabacum was carried out. A tremendous number of mesophyll protoplasts of N. tabacum were formed, up to 7$\times$105 protoplast per ml, for 20 hours in darkness in the enzyme solution of 0.5% cellulase and 0.1% macerosin, pH 5.8. The viabilities of the protoplasts were maintained above 80% for 6 days in the media containing 2mg/1 of NAA and 1mg/1 of kinetin. Calli were induced from the protoplasts and leaves of the N. tabacum on MS medium containing 0.5mg/1 BAP. Under the culture conditions the protoplasts underwent repeated cell division into calli. Plantlets were regenerated from callus cultures derived from protoplast and leaves. Shoots were induced in a medium containing 1mg/1 of BAP.

• 한국균학회지
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• 제14권3호
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• pp.215-223
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• 1986

원형질체(原形質體)를 이용한 버섯의 육종연구(育種硏究)를 하는데 있어서 원형질체(原形質體) 재생(再生) 및 환원(還元)은 필수적인 과정이라고 할 수 있다. 식용(食用)버섯의 일종(一種)인 P. cornucopiae 노랑 느타리버섯의 원형질체(原形質體) 재생(再生)에 적합한 제조건(諸條件)에 대해서 조사한 바를 요약하면 다음과 같다. 원형질체(原形質體) 재생(再生)에 적합한 삼투압 조절제(調節劑)와 농도(濃度)는 0.6M sucrose로 MCM에서 5.21%의 높은 재생률(再生率)을 보였고, agar를 포함하지 않은 0.6M sucrose 삼투압 조절제(調節劑)나 0.6M液 sucrose+MMM 체배지(體培地)만을 overlaying한 경우에 재생률(再生率)이 높았다. 노랑 느타리버섯의 균사(菌絲) 생장(生長)을 촉진시킨 아미노산, 핵산 구성 성분의 종류(種類)와 원형질체(原形質體) 재생률(再生率)을 증가시킨 종류(種類)는 유사하며 큰 차이가 없었으나 비타민에서는 다소 다른 경향을 나타냈다. 재생률(再生率)을 증가시킨 영양원(營養源)들을 혼합했을 때 무첨가 배지 MMM에 비해 아미노산 혼합, 핵산 구성 성분 혼합에서는 재생률(再生率)이 증가했으며 비타민 혼합에서는 오히려 감소하였고 아미노산, 핵산 구성 성분, 비타민 모두가 첨가된 데서 가장 높은 재생률(再生率)을 나타냈다. 고체(固體) 배지(培地)에서 원형질체(原形質體)가 $1{\sim}2$일 배양(培養)되었을 때 광학 현미경하에서 재생(再生) 형태(形態)를 첫째, one or two directgerm tube, 둘째, bud like structure, 세째, yeast-likecell chain, 네째는 한 원형질체(原形質體)에서 direct germ tube와 yeast-like cell chain을 형성하는 형태를 관찰할 수 있었으며 $3{\sim}4$일 배양(培養)때는 균사(菌絲)가 branch를 형성하며 성장하였고 결국 완전한 균사체(菌絲體)로 되어 노랑 느타리 자실체(子實體)를 형성하였다.

• 한국연초학회지
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• 제15권2호
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• pp.130-136
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• 1993

Protoplasts of palisade cells were aseptically isolated from leaves of Nicotiono apicona Merxm. by the one step enzymatic method. Efficiency of colony formation were depended on cell density and light condition during incubation, but an intensity of 47 ft-c during a period of 2 weeks after isolation of the protoplasts in the Nagata and Takebe's medium promoted the planting efficiency. Protoplast - derived calli of N. africana can be differentiated into shoot when cultured on Murashige and skoog's medium containing IAA(0.Smg/$\ell$) and zeatin(5.0mg/$\ell$).

• Applied Biological Chemistry
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• 제42권1호
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• pp.20-28
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• 1999

Biopolymer를 생산하는 Bacillus속의 균주개량의 목적으로 biopolymer를 생산하는 균주인 Bacillus subtilis K-1과 유당 이용능이 있는 Bacillus coagulans의 원형질체 형성과 재생에 관하여 조사하였다. 영양요구성과 항생제 내성의 marker가 부여된 두 변이주의 원형질체 형성조건에서 Bacillus subtilis mutant SM-2의 경우, 대수기 중기에 penicillin G(1.0 unit/ml)를 첨가한 다음 1.5시간 반응 후 삼투압 안정제로서 0.4 M sucrose와 $25\;{\mu}g/ml$의 lysozyme이 함유된 lysis fluid(LF, pH 7.0)내에서 $37^{\circ}$, 40분간 반응시켰을 때, 원형질체 형성율은 99.6%, 세포벽 재생율 2.4%였다. Bacillus coagulans mutant CM-12의 경우 대수기 중기에 penicillin G 0.3 unit/ml와 glycine 0.5%를 혼합첨가하고 1시간 반응시킨 후 삼투압 안정제로서 0.6 M lactose와 $300\;{\mu}g/ml$의 lysozyme이 함유된 LF(pH 7.0)내에서 $37^{\circ}$, 30분간 재생시켰을 때, 원형질체 형성율 90.8%, 세포벽 재생율 2.2%였다. 세포벽 재생효율을 높이기 위한 재생배지는 trypticase soy broth(TSB)에 0.4 M sucrose, 0.7% casamino acd, 1% PVP, 25 mM $CaCI_2$, 25 mM $MgCI_2$, 1.5% agar가 함유된 배지에 0.4% soft agar로서 중층 했을 때 Bacillus subtilis SM-2의 재생율은 5.1%, Bacillus coagulans CM-12의 재생율은 10.3%로 $2{\sim}4$배 가량 향상 되었다.

• 식물조직배양학회지
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• 제22권1호
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• pp.7-11
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• 1995

종자발아 후 5일된 양배추 그린챌린져 배축으로부터 분리된 원형질체로부터 완전한 식물체를 재분화 시켰다. Kao배지와 B5 배지를 기본으로 한 기존의 몇가지 배지에서 원형질체를 배양한 결과 변형시킨 BS배지에서 Plating efficiency는 낮았으나 식물체 재분화율은 가장 높게 나타나 거의 원형질체 배양배지 조성, 생장조절제 농도 등이 재분화에 상당한 영향을 주는 것으로 나타났다. 또한 사용된25가지 종류의 재분화 배지중에서 MS배지에 l% sucrose zeatin 3 mg/L, 1.6% T.C. agar가 첨가된 배지에서 재분화율이 가장 좋았다. 식물체 재분화에 미치는 PVP (polyvinyl Polypyrrolidone)와 agar 농도의 영향으로는 PVP는 큰 효과가 없었고 agar농도를 1.6%로 2배 증가시켰을 때 재분화율이 다소 높아졌다. 현재까지 재분화된 식물체는 150여 개체로서 포장에서 재배중에 있다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제16권2호
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• pp.163-167
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• 1988

Penicillium verruculosum으로부터 유도된 영양요구성 돌연변이주간의 원형질체 융합을 위한 조건을 검토하였다. 20시간 배양한 P. verruculosum의 균사체에 Novozym 234를 처리하여 원형질체를 추출할 수 있었다. 원형질체 생성 최적조건하에서의 원형질체 생성량은 각 영양요구성 변이주의 균사체 400mg 당 2.4~3.0$\times$$10^7$ 수준이었고, 재생율은 36.6~42. 4%, RMM에서의 환원율은 $10^{-7}$ 수준이었다. 원형질체 융합을 위한 PEG6000의 최적농도는 20%였고, PEG 최적처리시간은 10분, CaCl$_2$최적첨가농도는 10mM, 최적 pH는 5.5였으며, 융합 최적조건 하에서의 융합율은 1.8$\times$$10^{-3}$~3.5$\times$0$^{-3}$ 수준으로 나타났다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제49권4호
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• pp.331-338
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• 2022

Sunflower (Helianthus annuus L.) protoplasts were isolated from seven-day-old etiolated hypocotyls of 10 A line and four-week-old fully expanded young leaves of PI 441983 line in vitro seedlings using an enzymatic method. Purified protoplasts were collected by filtration and floatation in sucrose solution. Semi-solid protoplast culture was performed using the L4 regeneration protocol with various culture media and plating densities to achieve the highest efficiencies for protoplast culture of hypocotyl and mesophyll protoplasts of 10 A and PI 441983 lines, respectively. The concentrations in liquid L'4M medium and different plating densities were evaluated in two types of cytokinins, the adenine-type 6-benzyladenine (BA) and the phenylurea-type thidiazuron (TDZ). The highest colony formation was achieved in both sunflower lines when 0.5 mgL^-1 BA and 0.5 mgL^-1 TDZ were applied with a high plating density (3 × 10⁵ protoplasts mL^-1). These conditions led to 38.45% and 39.40% colony formation for hypocotyl protoplasts of the 10 A line and mesophyll protoplasts of the PI 441983 line, respectively. Moreover, many hypocotyl protoplast-derived colonies developed into micro-calli. In addition, superior development of both sunflower protoplasts was observed with all plating densities when BA was used in combination with TDZ. This finding will be applicable to future sunflower hybrid production via somatic hybridization.