• 자연과학논문집
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• 제4권
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• pp.103-142
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• 1991

표식 유전자를 이용하여 체세포 잡종체를 선발하기 위한 연구의 일환으로 감자조직에는 T-DNA를 도입하여 식물호르몬 무첨가 배지에서도 생장가능한 형질전환체을 획득하고, 담배조직에는 NPT H gene을 도입하여 kanamycin에 대해서 저항성을 나타내는 형질전환체를 획득하여 각각의 특성구명과 원형질체를 유리하여 도입된 유전자 marker를 이용해서 융합을 시도한 바 그 결과는 다음과 같다. 1. 감자 괴경에서 Agrobacterium tumefaciens Ach5와 A. rhizogenes ATCC15834를 접종하여 crown gall tumor 및 hairy root를 유기하였으며 이러한 tumor조직은 식물 호르몬 무첨가 배지에서 생장이 가능하였다. 2. 감자에서 유기된 hairy root로부터 callus 형성은 2.4-D 2mg/1 첨가된 MS 배지에서 가장 양호하였으며 casein hydrolysate 1g/1가 첨가하면 유연 한 callus의 증식이 더욱 왕성하였다. 3. Activated charcoal이 0.5~2.0g/1 첨가된 배지에서는 crown gall tumor callus의 절단면이 갈변되는 것을 방지 할 수 있어 생존률을 높일 수 있었으나 hairy root에서는 갈변되어 고사되었다. 4. 2, 4-D 2mg/1와 casein hydrolysate 1g/1를 첨가한 배지에 hairy root callus를 현탁배의한 결과 양호한 많은 callus 덩어리들을 단시간에 얻을 수 있었다. 5. $Tri^-$parental mating으로 NPTII gene이 coding되어있는 binary vector인 pGA643을 wild type 및 disarmid된 Agrobacterium 내에 도입하여 Agrobacterium tumefaciens Ach5/pGA643, A.tumefaciens $A_4T$/pGA643, A. tumefaciens LBA4404/pGA643를 획득하였다. 이 세 개의 conjugant를 사용하여 0.7% agarose gel 상에서 pGA643을 확인하였다. 6. pGA643이 도입왼 Agrobacterium tumefaciens LBA4404와 담배 조직과 동시배양하여 kanamycin $100\mug$/ml 첨가된 배지에 생존하는 callus를 선발하였으며 동일배지에서 callus의 증식이 가능하였다. 7.형질전환된 담배 callus로부터 식물체 형성은 BA 2mg/1를 첨가한 배지에서 가능하였다. 8. 재분화된 담배의 엽조직은 kanamycin.이 $1000\mug$/ml 첨가된 MS 배지에서도 왕성히 callus가 유기되어, 이는 재분화체에서도 NPTII gene이 그대로 유지되고 있음을 확인할 수 있었다. 9. 담배의 정상 shoot와 형질전환된 shoot를 kanamycin이 $100\mug$/ml이 함유된 MS배지에 기내삽목한 결과, 정상 shoot는 발근이 되지 않고 황화 되었으나 형질전환된 shoot는 발근이되었으며 정상적으로 생장을 하였다. 10. 감자의 T-DNA가 도입된 현탁배양 callus는 cellulase 2%, macerozyme 2%, dricelase 1%에서 양호하게 유리되었다. 11. Osmoticum으로서 mannitol 농도 0.8M에서 담배와 감자의 두 조직 모두 원형질체유리가 가장 효과적이었다. 생존력은 T-DNA가 도입된 감자의 hairy root를 callus로 탈분화 시킨 후 현탁배양한 callus가 mannitol 0.5M에서 97%를 나타냈고, 그리고 NPTII gene이 도입된 담배의 엽조직은 mannitol 0.7M에서 94%로 최고를 타나냈다. 12. 원형질체 융합은 PEG solution 처리 15분 후부터 관찰되기 시작하여 20분에 완전히 융합되었고, 융합된 원형질체는 선발 marker인 호르몬 무첨가 및 kanamycin 첨가배지에서 배양 5일 후에 세포벽이 재생되었으며 4주일 후부터 colony들이 관찰되었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제9권2호
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• pp.168-172
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• 1999

The antifungal mechanism of the antifungal peptide against Aspergillus fumigatus, $K^{18,19}$-CA(l-8)-ME(l-12), derived from cecropin A(l-8)-melittin(l-12) was investigated by confocal laser scanning microscopy, cell wall regeneration, ATPase activity inhibition, and released potassium ion. By confocal laser scanning microscopy, $K^{18,19}$-CA(l-8)-ME(l-12) was detected on the surface of A. fumigatus, while cecropin A used as a negative control peptide was not detected. The protoplast of A. fumigatus treated with$K^{18,19}$-CA(1-8)-ME(1-12) failed to regenerate the fungal cell walls. Compared with cecropin A, the amount of potassium ion released by $K^{18,19}$-CA(l-8)-ME(l-12) was increased. Furthermore, $K^{18,19}$-CA(l-8)-ME(l-12) inhibited the ATPase activity on the plasma membrane. These results suggested that $K^{18,19}$-CA(l-8)-ME(1-12) acts on the plasma membrane of A. fumigatus and its antifungal action is due to the ion channel or pore formation on the plasma membrane.

• 식물조직배양학회지
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• 제27권2호
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• pp.125-131
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• 2000

원형질체는 현탁배양된 세포괴로부터 1% cellulase R-10, 0.25% pectolyase Y-23, 그리고 0.5% driselase가 포함된 CPD 효소용액에서 4시간의 진탕 (40 rpm)조건에서 쉽게 분리되었다. 분리된 원형질체는 1 mg/L 2,4-D, 0.5 mg/L kinetin , 200 rng/L spermidine 그리고 68 g/L glucose가 포함된 KM 액체배지에서 배양되었으며, 또한 현탁배양중인 동종의 feeder cell이 있는 CP배지 위에 액체배양배지를 1 mL균일하게 퍼트린 후,$25^{\circ}C$, 암조건으로 4주간 양육배양하였다. 원형질체 유래 SF 캘러스는 0.05 mg/L IAA, 7 mg/L 2lip와 30mg/L sucrose가 첨가된 MS 재분화 배지에서 광조건으로 4주동안 배양되었을 때, 60% 이상의 shoot를 형성하였다. 이후, 식물의생장조절물질이 첨가되지 않은 MS 배지로 옮겨 뿌리를 유도하였으며, 재분화된 식물체는 토양으로 옮겨 배양 8주후에 종자를 형성하였다.

• 농업과학연구
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• 제15권1호
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• pp.15-22
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• 1988

팽이버섯 원형질체(原形質體)의 재생(再生)과 환원(還元)에 영향(影響)을 미치는 요인(要因)에 대해 조사(調査)하였으며 영양요구성(營養要求性) 돌연변이(突然變異) 균주(菌株) 선발(選拔)을 실시(實施)하여 얻은 결과(結果)는 다음과 같다. 1. 원형질체(原形質體) 재생배지(再生培地)에 첨가(添加)되는 삼투압 조절제(調節劑)로는 0.6M의 sucrose가 가장 우수(優秀)하였고 재생률(再生率)은 0.47~1.32%로 나타났다. 재생용(再生用) 배지(培地)에 몇가지의 영양원(營養源)을 첨가(添加)하였을때 재생률(再生率)의 증가(增加)를 나타내었으며 특히 yeast extract가 팽이버섯의 원형질체(原形質體) 재생(再生)에 효과적(效果的)이었다. 2. 팽이버섯의 원형질체(原形質體) 재생(再生) 형태(形態)는 bud-like cells에서 germ tube가 발달(發達)하는 형태(形態)이었다. 환원(還元)된 균총중(菌叢中)에는 13~18%의 clamp connection을 형성(形成)하지 않는 monokaryon 균주(菌株)들이 발견(發見)되었다. 3. 자외선(U.V.L) 조사시(照射時) 팽이버섯의 포자생존률(胞子生存率)은 180사(砂)에서 16%였고 이때 5계통(系統)의 영양요구성(營養要求性) 균주(菌株)가 선발(選拔)되었다. 이들 중(中) 2균주(菌株)는 nucleic acid requiring strain이었고 3균주(菌株)는 vitamine requiring strain이었다.

• 한국산림과학회지
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• 제77권2호
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• pp.208-215
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• 1988

현사시(Populus alba ${\times}$ glandulosa) 기내배양(器內培養)한 엽육조직(葉肉組織)에서 원형질체(原形質體)를 분리(分離), 배양(培養)하여 식물체(植物體) 재분화(再分化) 과정(過程)에 관(關)해 조사(調査) 검토(檢討)하였다. $NH_4NO_3$를 뺀 MS배지(培地)에 BAP 0.5mg/l와 2.4-D 2.0mg/l를 첨가(添加)하여 liquid plating 법(法)으로 원형질체(原形質體)를 배양(培養)하였을때 비교적(比較的) 높은 세포분열(細胞分裂)이 일어났다. colony 형성율(形成率)은 gauze를 넣은 semi-solid agar plating 법(法)에서 가장 높게 일어나서 배양(培養) 5주후(週後)에는 micro-callus가 형성(形成)되었다. gauze를 제거(除去)한 후(後)에는 원형질체(原形質體) 분리배양후(分離培養後) 8주(週)가 되었을때 mini-callus가 형성(形成)되었으며 이들 callus는 2, 4-D 0.5mg/l와 BAP 0.1mg/l를 첨가(添加)한 MS배지에서 증식되었다. shoot 형성(形成)은 zeatin 1.0mg/l를 첨가(添加)한 배지에서 이식한지 3주(週)만에 일어나기 시작했으며 6주후(週後)에 뿌리발달을 도모하고져 생장조절물질(生長調節物質)이 첨가(添加)되지 않은 1/2MS배지로 이식하였다. 이식한지 4주후(週後)에 많은 뿌리가 형성(形成)되었다. 발근(發根)이 된 개체(個體)는 온실(温室)에 이식(移植)하였는데 원형질체(原形質體)를 분리(分離)하여 완전식물체(完全植物體)로 분화(分化)시켜 온실(温室)에 이식(移植)하기 까지는 22주(週)가 걸렸다.

• 한국균학회지
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• 제24권2호통권77호
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• pp.111-126
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• 1996

표고 Lentinus edodes의 균사체로부터 핵을 분리하여 사철느타리 Pleurotus florida 원형질체에 폴리에틸렌 글라이콜로 전이하여 속간(屬間) 핵전이체(核轉移體)를 16균주 얻었다. 주된 핵전이주는 합핵체(合核體) synkaryon 또는 이질핵체로 꺽쇠연결체 clamp connections가 없었다. 그러나 톱밥배지를 이용하여 일정한 저온상태에서 광을 조사하여 꺽쇠연결체를 가진 균사가 다시 생장하여 사철느타리와 유사한 자실체를 형성하였으나 갓색택은 다소 달랐다. 꺽쇠연결체 형성에 영향을 주는 주요한 요인으로는 광, 온도, 배지의 영양, 배지의 생리적 상태로 나타났다. 핵치환체(核置換體) reconstituted cell는 꺽쇠연결체를 가진 표고와 유사한 균총형태로 자실체도 표고와 거의 유사하였다. 핵융합체(核融合體) nuclear hybrid는 이질배수체(異質倍數體) heteroploid로 균총생장이 빠르고 benormyl 첨가배지에서 균총분리가 나타나며 꺽쇠연결체와 자실체를 형성하지 않았다. 동위효소 esterase, leucine aminopeptidase 분석결과 핵융합체는 전혀 새로운 벤드양상이었으나 합핵체는 사철느타리의 주된 밴드를 형성하면서 양친에 없는 다소의 새로운 밴드를 형성하여 구분되었다. PCR에 의한 RAPD 벤드의 크기는 0.25-4.0 Kb였으며 유전유사도 분석으로 5군으로 구분할 수 있었는데 표고와 핵치환체, 핵합체 p669, 사철느타리와 12 핵합체, 핵융합체 p674, 핵융합체 p678이었다. 합핵체의 담자포자로 2 핵전이체를 유전분석한 결과 원영양형(原營養型) prototroph과 영양요구형(營養要求型) riboflavine으로 분리되었는데 그 비는 1 : 1, 1 : 2였다.

• KSBB Journal
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• 제25권2호
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• pp.155-166
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• 2010

Inonotus obliquus 균사체의 액상배양을 통해 항당뇨 및 면역증강 효능의 세포벽다당체 (IPS) 생산 공정을 개발하기 위한 첫 시도로서, 고생산성 균주를 개발하는 연구를 수행하였다. Inonotus obliquus는 균사체로 성장할 때 포자를 형성하지 못하므로 단일 세포주를 얻기가 힘든 것으로 관찰되었다. 따라서 Inonotus obliquus 균사체로부터 대량의 원형질체 형성 및 재생에 의한 단일 콜로니 획득 방법을 개발함으로써 생산균주를 신속하게 개량하고자 하였다. 개량된 filtration 방법을 적용해서 원형질체를 회수한 결과, 기존의 trapping 방법에 의해 회수한 수보다 약 5배 증가한 $2.3{\times}10^6$ protoplasts/mL의 원형질체를 회수할 수 있었으며, 원형질체 재생률 또한 $10^{-2}{\sim}10^{-3}$로서 비교적 높게 나타났다. 한편 Inonotus obliquus 균사체의 경우 IPS의 함량이 세포 무게 당 거의 일정한 양을 함유하고 있는 것으로 확인되었으므로, IPS의 생산성을 증가시키기 위해서는 최종 액상 생산배양에서의 균체량 증가가 가장 중요한 것으로 판단되었다. IPS 고생산성의 균주를 개발하기 위해, 이미 선별된 고생산성 균주들의 균사체를 다양한 조건으로 UV 처리한 후, 생존한 원형질체로부터 고생산성의 변이주들을 지속적으로 선별한 결과, 16~18 g DCW/L 범의의 높은 균체 생산성을 보이는 우량균주들을 다수 선별할 수 있었다. 특히 고체 성장배지에서 빠른 성장속도를 보여주는 대부분의 균주들이 최종 액상 생산배양에서도 고생산성 및 고안정성을 보여주는 것으로 나타났다. 이 결과로부터 일련의 균주 개발 공정의 초기 단계에 속하는 고체 성장배양에서 성장속도가 낮은 균주들을 미리 제외시킬 경우, 균주선별의 효율성이 매우 높아짐을 확인할 수 있었다. 최종적으로 97%의 치사율을 보이는 UV 변이처리 조건에서 균사체 생산성이 약 22 g/L에 이르며, 생산 안정성도 높은 우량 균주 (OBLQ756-15-5)를 획득할 수 있었는데, 이 균주를 이용하여 현재 IPS 대량 생산을 위한 pilot-scale 발효조 배양공정을 개발 중이다.