Microbial proteases have certain unique characteristics, and are now widely used in food, leather, detergent, and pharmaceutical industries. Thermophilic Actinomyces producing the protease was isolated from soil in Wonju city. This strain was able to grow and produce protease at the culture temperature of 50$^{\circ}C$. The maximum protease production was obtained when 0.5% soluble starch and 0.4% yeast extract were used as carbon and nitrogen source, respectively. The other culture condition for the maximal productivity of the protease was 0.1% K2HPO4, and 0.05% CaCl2 at initial pH 8.0 for 48 hours.
Objectives : Kyenegum has been popularly used long as the digestive. The purpose of this study was to investigate the purification and characteristics of protease obtained from Kyenegum crude enzyme. Methods : Kyenegum protease was purified by precipitation with ammonium sulfate followed by SP-Spharose ion exchange chromatography. The molecular weight of Kyenegum protease was estimated by SDS-PAGE electrophoresis. Results : Kyenegum protease was 3,087 units/mg protein specific activity, 14.5 purification fold and 9.8 % recovery. The molecular weight of protease was estimated to be 18 kDa. The isoelectric point was pI 8.97 and values of Km and Vmax of its were 48 mg/mL and 2 units/min, respectively. Conclusion : The result suggests that the protease obtained from Kyenegum has excellent stability of temperature, acid and collagen substrate specificity.
HIV-1 protcase 를 이용한 in vitro assay system을 개발하기 위하여HIV-1 protease유전자를 Ecoli 발현 벡터를 이용하여 발현시켰다. 가능성있는 Protease유전자의 생간 및 분래를 용이하게 하기위하여 maltose binding protein 의 fusion protein을 이용하였으며 protease 의 autoprocessing을 maltose binding protein 의 polyclonal 항체로 확인하였다, 발현된 protease는 일련의 chromatography 방법 (DEAE, SE cellulose, Superose 12, Mono S) 으로 순수하게 분리되었다. 정제된 protease 는 SDS-PAGE분석으로 단일밴드를 보여주었고, 합성된 undecapeptide를 기질로 하였을때 Km 이 9.8$\mu$M 이었다. 효소 assay 를 위해 기질이 protease 에 의해 절단된 생성물을 HPLC를 사용하여 분석하였다. Protease의 억제제 탐색을 위해 유기합성한 몇개의 기질유사체와 HIV-1 증식을 억제하는 것으로 알려진 천연물의 억제정도를 조사하여 보았다. 이들 test 에 사용한 물질들은 높은 농도에서 protease 의 활성을 저해하는 것으로 보아 좋은 억제제는 아닌것으로 시료되나 본 연구를 통하여 확립된 in vitro assay system 은 추후에도 억제제 탐색을 위하여 계속 활용될 수 있을 것이다.
In this study, a 107 kDa protease from psychrophilic Janthinobacterium lividum PAMC 26541 was purified by anion-exchange chromatography. The specific activity of the purified protease was 264 U/mg, and the overall yield was 12.5%. The J. lividum PAMC 25641 protease showed optimal activity at pH 7.0-7.5 and $40^{\circ}C$. Protease activity was inhibited by PMSF, but not by DTT. On the basis of the N-terminal sequence of the purified protease, the gene encoding the cold-adapted protease from J. lividum PAMC 25641 was cloned into the pET-28a(+) vector and heterologously expressed in Escherichia coli BL21(DE3) as an intracellular soluble protein.
미생물에 의한 단백질 분해 효소인 protease생산에 있어 탄소원과 질소원의 영향은 매우 중요한 것으로 알려져 있다. Bacillus licheniformis에 의한 protease생산에 있어서 탄소원과 질소원의 영향을 규명하기 위해서 제한배지를 사용하여 회분식 배양을 수행하였다. 탄소원의 농도가 높을수록 그리고 질소원의 농도가 높을수록 Bacillus licheniformis의 성장은 촉진되나 proteased의 생합성 비율은 감소됨을 알았다. 또한 회분식 배양 결과로부터 탄소원과 질소원의 영향을 고려한 수학적 모델식을 제안하였으며 제안된 수학적 모델식을 사용하여 탄소원과 질소원을 적절히 공급하므로서 protease의 생산성을 증대시킬 수 있었다.
대부분의 알려진 알러젠들은 단백분해효소의 성격을 가지고 있고 이는 알레르기 반응에서 Th2 면역 반응을 일으키는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 단백분해효소들과 반응하는 것으로 알려진 protease activated receptor (PAR) 는 4가지 종류가 있으며, 이 중 PAR2의 경우 알레르기 질환과 많은 상관관계를 보여 많은 연구가 되고 있다. 본 연구는 Aspergillus protease 알러젠에 의한 초기 및 만성 Th2 면역반응에서 PAR2 의 역할을 규명하기 위해 Aspergillus protease 알러젠으로 정상쥐와 PAR2 유전자 결핍쥐 모두 Th2 반응을 유도한 후 면역세포의 침윤 정도 및 Th2 관련 cytokine 및 chemokine 유전자들의 발현 정도를 비교하였다. 그 결과 Aspergillus protease 알러젠으로 비강내로 1회 처리했을 경우 중성구의 침윤이 두드러지는데, 이때 PAR2 결핍 마우스는 이러한 면역세포의 침윤이 유의적으로 감소하였다. 또한, 이와 관련된 IL-25, TSLP, Eotaxin 유전자들의 발현 역시 PAR2 결핍 마우스에 현저히 감소하였다. 한편, Aspergillus protease 알러젠으로 비강내로 6회 처리했을 경우 중성구 대신 호산구의 침윤이 두드러지지만 PAR2 결핍 마우스에서 그 정도가 유의적으로 낮았다. OVA 특이 IgE와 IgG1 농도 역시 현저하게 PAR2 결핍 마우스에서 낮았고, CCL21의 발현이 PAR2 결핍마우스 MEF cells에서 현저히 감소하였다. Th2 초기 면역반응에서 가장 중요한 IL-25의 발현에 MAKP p38 pathway가 관여한다는 것을 이번 연구에서 알 수 있다. 본 연구를 통해 Aspergillus protease 알러젠으로 유도된 알러지성 기관지 염증 반응에서 초기 반응뿐만 아니라 만성반응에서도 PAR2가 중요한 것을 알 수 있다.
인삼액기스의 첨가량을 달리한 배지에 시간별로 국균의 첨가력($\alpha$-amylase, $\beta$-amylase, protease)에 미치는 영향을 조사한 결과는 다음과 같다. 1) Asp. oryzae의 $\alpha$-amylase 활성도는 48시간 배양까지는 대조구보다 다소 높았으나 그 이후는 같은 경향을 나타내었고, Asp. oryzae의 $\beta$-amylase 활성도는 배양 24시간에서 인삼엑기스, 첨가량순으로 촉진되어 1%구까지 증가하고 3~5%구는 그 활성이 첨가량 순으로 감소되었다. Asp. oryzae의 protease 활성도에서 acid protease는 배양 72시간까지 대조구보다 활성이 높았고, 그중 3.0%구의 48시간때가 가장 역가가 높았으며 120시간 배양에서는 인삼엑기스 3.0% 이상이 효소활성의 감소가 컸다. Alkaline protease는 대조구보다 객처리구의 역가가 떨어졌다. 그러나 alkaline protease는 aeid protease보다 활성도가 높았다. 2)Asp. niger의 $\alpha$-amylase 활성도는 인삼엑기스 첨가량 순으로 높아지고 그 활성이 급증가하였다가 급감소되는 경향을 보였고, Asp. niger의 $\beta$-amylase 활성도는 인삼엑기스, 첨가량에 따라 활성이 높아졌으며 0.5~3.0% 첨가시에는 대조구 및 5.0%보다 활성이 빨고 높게 나타났으며 5.0구는 그 활성이 억제되었다. Asp. niger의 protease 활성도는 acid protease가 alkaline protease보다 효소역가가 현저하게 높았다. acid protease는 배양 48시간까지는 인삼엑기스의 첨가량에 따라 효소역가가 조해되었으나 72시간에서는 인삼엑기스 첨가량 순으로 역가가 높았고, 단 5.0%구만 현저하게 효소력이 감소되었다. Alkaline protease는 배양 24시간에서 48시간까지는 0.1%구와 0.5%구가 대조구보다 효소력이 높았고 그 이상의 인삼엑기스가 첨가된 처리구보다 효소력이 낮았다. 그러나 48시간 이후부터는 효소력은 인삼엑기스 첨가량 순으로 감소를 나타내었다.
알칼리성 protease를 생산하는 호알칼리성 균주를 분리하여 Bacillus pseudofirmus HS-54로 동정하였고, HS-54가 생산하는 알칼리성 protease를 ammonium sulfate 침전, DEAE cellulose chromatography, sephadex G-100 gel filtration을 통과시켜 정제하였는데, 정제된 protease의 분자량은 27 kDa이었다. 정제된 효소의 반응최적 pH는 10.0이었고 pH 7.0-11.0에서 비교적 안정하였다. 또한 정제된 효소의 반응최적 온도는 $50^{\circ}C$이었고 $10-55^{\circ}C$에서 안정하였다. 금속이온에 대한 영향은 $Ca^{2+}$와 $Mg^{2+}$ 등에 의해 효소활성이 촉진되었으나, $Hg^{2+}$, $Zn^{2+}$, $Cu^{2+}$, $Al^{3+}$ 등에 의해서 효소활성이 저해되었다. 본 효소는 PMSF에 의해 강하게 저해를 받는 것으로 보아 serine protease에 속하는 것으로 판단된다.
Kim, Kwang-Il;Lee, Sang-Yoon;Kim, Soo-Jin;Seo, Jae-Hee;Lee, Joong-Kyu;Shin, Jung-Kue;Cho, Hyung-Yong;Choi, Mi-Jung
한국축산식품학회지
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제36권1호
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pp.114-121
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2016
This study was performed to improve the techniques used for tenderizing red meat as elderly food. Beef meat was immersed in liposome encapsulated enzyme solution and the effect of protease encapsulation on the beef properties was analyzed. The protease encapsulation properties were analyzed according to the size distribution and enzymatic activity. After enzyme reaction on the beef, the chemical properties of the meat such as pH, water holding capacity, shear rate, lipid oxidation and total volatile basic nitrogen (TVB-N) were analyzed. The pH of the beef increased during the reaction and coating protease (CP) was higher than non-coating protease (NCP). Total color differences were increased remarkably after 36 h and generally, the difference in CP was relatively lower than in NCP. WHC was significantly decreased within 24 h, and no effect from the protease coating was observed. Protease activity was significantly increased within 48 h and no differences in the enzyme coating were observed. The TVB-N value of NCP was increased within 24 h while CP was sustained for up to 36 h. The TVB-N value of protease treated meat increased after 36 h and no effect from the protease coating was detected. Consequently, liposome encapsulated protease was found to have similar properties as non-coated protease. Application of liposome seems to be an interesting option for injecting various functional materials without changing the properties of meat.
대장균의 세포질내에 존재하는 단백질 분해효소(protease Ci)를 추출하여 그 성질을 조사하였다. 이 효소는 insulin, glucagon 및 bovine growth hormone을 분해시키나, bovine serum albumin, casein 및 globin 등은 분해시키지 않는다. 이 효소의 native 한 상태에서의 분자량은 120,000이며, 54,000 dalton의 동일한 2개의 subunit로 구성되어 있다. Protease Ci의 최적 pH는 7.5이며 등전점은 5.5이다. 이 효소는 o-phenanthroline에 의해 저해되며, $Mn^++나 Co^++$와 같은 metal 이온들에 의하여 활성화되므로 metalloprotease임을 알 수 있다. 이 효소는 p-hydroxymercuribenzoate에 의해서 크게 저해되나 sulfhydryl protease의 specific한 저해제인 Ep475와 leupeptin에 의해서는 영향을 받지 않는다. 대장균 세포내에서는 또 다른 insulin 분해효소 (protease Pi)가 존재하는데, 이 효소는 periplasm에 존재하므로 protease Ci와는 다르다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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