• 한국가축번식학회지
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• 제19권3호
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• pp.227-234
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• 1995

본 연구는 1-세포기배의 glucose에 대한 노출이 상실배기 이후의 배발생에 미치는 영향을 검토하고자 실시되었다. hCG 주사 후 24~25시간 째에, F1hybrid(C57BL/6, ♀ $\times$CBA/N, ♂) 계통 생쥐를 도살하여 1-세포기배를 회수한 후 0.1% hyaluronidase로 처리하여 난구세포를 제거하였다. 1-세포기배는 hCG 주사 후 72시간째 다양한 농도의 glucose(5.5, 16.5, 27.5 및 38.5mM)에 1분 노출 후 glucose가 첨가되어 있거나 혹은 첨가되지 않은 CR1aa배양액에서 계속 배양함으로써 배발생을 유도하였다. 이 실험의 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. M2 배양액에서 회수한 후 3mg/ml의 Fatty-acid free BSA가 첨가된 배양액에서 배양한 경우 27.5%의 확장배반포까지의 배발생율과 16.6%의 탈출 배반포까지의 배발생율을 나타낸 반면, TL HEPES 배양액에서 회수한 경우는 전혀 상실배기 이후의 배발생이 나타나지 않았다. 2. hCG 주사 후 72시간째에 단 1분간의 27.5mM glucose에 대한 노출만으로도 68.8% (CR1aa＋BSA)와 77.1%(CR1aa＋FBS)의 확장배반포까지의 발생을 유도할 수 있었다. 그러나 1분 노출과 이후 계속되는 노출간에는 배발생에 있어서 유의차는 인정되지 않았다. 3. hCG 주사 후 72시간째에 5.5, 16.5, 27.5 및 38.5mM의 glucose 첨가에 따른 확장 배반포까지의 배발생율은 45.7~61.5%로 각 처리군의 유의차는 없었으며, 따라서 고농도의 glucose 첨가에 따른 저해효과는 확인할 수 없었다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제35권1호
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• pp.33-45
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• 2011

Heat shock protein 90 (Hsp90) is ATPase-directed molecular chaperon and affects survival of cancer cell. Inhibitory effect of Hsp90 by inducing cell cycle arrest and apoptosis in the cancer cell was reported. However, its role during oocyte maturation and early embryo development is very insufficient. In this study, we traced the effects of Hsp90 inhibitor, 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG), on meiotic maturation and early embryonic development in pigs. We also investigated several indicators of developmental potential, including structural integrity, gene expression (Hsp90-, cell cycle-, and apoptosis-related genes), and apoptosis, which are affected by 17-AAG. Then, we examined the roles of Hsp90 inhibitor on viability of primary cells in pigs. Porcine oocytes were cultured in the NCSU-23 medium with or without 17-AAG for 44 h. The proportion of GV arrested oocytes was significantly different between the 17-AAG treated and untreated group (78.2 vs 34.8%, p<0.05). After completion of meiotic maturation, the proportion of MII oocytes was lower in the 17-AAG treated group than in the control group (27.9 vs 71.0%, p<0.05). After IVF, the percentage of penetrated oocytes was significantly lower in the 17-AAG treated group (25.2%), resulting in lower normal pronucleus formation (2PN of 14.6%). Therefore, the inhibition of meiotic progression by Hsp90 inhibitor played a critical role in fertilization status. Porcine embryo were cultured in the PZM-3 medium with or without 17-AAG for 6 days. In result, significant differences in developmental potential were detected between the embryos that were cultured with or without 17-AAG. Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) showed that the number of containing fragmented DNA at the blastocyst stage increased in the 17-AAG treated group compared with control (7.5 vs 4.4, respectively). Blastocysts that developed in the 17-AAG treated group had low structural integrity and high apoptotic nuclei than those of the untreated control, resulting in decrease the embryonic qualities of preimplantation porcine blastocysts. The mRNA expressions of cell cycle-related genes were down-regulated in the 17-AAG treated group compared with control. Also, the expression of the pro-apoptotic gene Bax increased in 17-AAG treated group, whereas expression of the anti-apoptotic gene Bel-XL decreased. However, the expression of ER stress-related genes did not changed by 17-AAG. Cultured pESF cells were treated with or without 17-AAG and used for MIT assay. The results showed that viability of pESF cells were decreased by treatment of 17-AAG ($2{\mu}M$) for 24 hr. These results indicated that 17-AAG decreased cell proliferation and increased cell death. Expression patterns Hsp90 complex genes (Hsp70 and p23), cell cycle-related genes (cdc2 and cdc25c) and apoptosis-related genes (Bax and Bcl-XL) were significantly changed by using RT-PCR analysis. The spliced form of pXbp-1 product (pXbp-1s) was detected in the tunicamycin (TM) treated cells, but it is not detected in 17-AAG treated cells. In conclusion, Hsp90 appears to play a direct role in porcine early embryo developmental competence including structural integrity of blastocysts. Also, these results indicate that Hsp90 is closely associated with cell cycle- and apoptosis-related genes expression in developing porcine embryos.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제18권2호
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• pp.133-142
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• 1991

본 연구의 목적은 임신 초기 자궁 조직중의 cyclic nucleotide 의 변화 및 PAF 가 이들에 미치는 영향을 관찰함으로써 PAF 가 흰쥐의 초기 임신에 어떻게 관련하는지를 조사하기 위함이다. 시험구로써 임신 각 일에 $1{\mu}g$ 의 PAF 혹은 이것의 수용체 길항제인 1.25mg의 BN-52021이 근육내 조사되었고 비 임신구 및 대조구에 대하여는 PBS만이 주사되었다. 자궁 조직중의 cAMP 및 cGMP 농도는 분석용 test kit를 사용하여 분석되었다. 비 임신구 경우 자궁 조직중 cAMP 농도는 단백질 mg 당 $2.91{\pm}0.33$ pmol로서 임신 보다도 낮았고 cGMP 농도 또한 $0.39{\pm}0.20$ pmol로서 임신구보다 낮은 경향이 었다. 자궁 조직중 cAMP 의 최고농도는 임신 3일째 ($5.92{\pm}1.72$ pmol/mg protein) 였고 cGMP 경우는 임신 4일째($1.03{\pm}0.22$ pmol/mg protein) 이었다. 임신 각일에 PAF 는 PAF 처리하지 아니한 대조구에 비하여 증가된 cAMP 를 보여주었으나(임신 0, 2, 그리고 4 일째 경우 p<0.05) BN-52021은 감소된 경향을 나타내었다. cGMP에 대하여는 PAF나 BN-52021 공히 일정한 효과적 경향을 보이지 아니하였다. 따라서, 임신은 자궁 조직중 cyclic nucleotide에 영향을 미칠 수 있으며 흰쥐의 착상기동안 PAF는 cGMP에 대하여 보다는 cAMP에 영향을 미침으로써 착상에 관련된 일련의 반응에 영향을 미칠 것으로 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제26권1호
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• pp.61-68
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• 2002

본 연구는 aesculetin과 $O_2$농도가 체외에서 성숙 수정된 한우 초기배의 체외발육에 미치는 영향을 검토하였다. 실험을 위하여 체외수정 후 40~44시간에서 2~8세포로 발육한 초기배는 6일간 배양하였다. 그 결과, 실험 1에서 상실배와 배반포기배의 발육은 산소농도 20% 보다는 5%에서 유의 적으로 높게 나타났으며 (P＜0.05), 1 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$의 aesculetin 첨가시 0, 5, 및 10 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ 첨가에 비하여 유의적 (P＜0.05)으로 높은 발육율을 나타냈다 실험 2에서, 배반포기 및 상실배 이상 발육한 초기배의 비율은 산소농도 20%보다는 5%에서 역시 유의적으로 더 높았으며 (P＜0.05), 1$\mu\textrm{g}$/$m\ell$의 aesculetin 또는 2.5mM taurine 첨가시 배반포기 및 상실배 이상 발육한 초기배의 비율은 다른 실험구에 비하여 유의적으로 높게 나타났다 (P＜0.05). 실험 3에서, aesculetin과 PDGF 동시 첨가 및 taurine과 EGF를 동시에 첨가한 경우 다른 실험구에 비하여 유의적으로 높은 발육율을 얻었으며 (P＜0.05), aesculetin 무첨가 보다는 첨가시 배반포기배의 세포수가 높게 관찰되었으나 배양조건에 관계없이 유의적인 차이는 인정되지 않았다. 한편, 실험 4에서 자연에서 추출한 것과 상품화된 aesculetin이 초기배의 발육에 미치는 영향을 검토한 결과 무첨가에 비해 유의적으로 높은 발육율을 나타냈으나 (P＜0.05), 자연에서 추출한 것 (71%)과 상품화 (70%)된 aescuietin 사이에 유의적인 차이는 인정되지 않았다. 또한 자연에서 추출한 것과 상품화된 aesculetin 첨가시 무첨가에 비해 배반포기배의 세포수가 높게 관찰되었으나 이들 사이에 의한 유의적인 차이는 없었다. 본 연구의 결과로부터, 5%의 산소농도하에서 aesculetin은 항산화제와의 공동첨가에 의해 한우 초기배의 체외발육을 증진시키는 것으로 나타났다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제3권1호
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• pp.75-85
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• 1999

생쥐 초기 배아의 형태형성에 영향을 주는 세포질내 인자의 기원과 작용기작을 연구하기 위해 단백질 합성과 단백질 활성화 효소 (protein kinase)의 억제제를 처리한 배아의 세포질로 재조합된 배아에서 발생과 RNA합성, 단백질 인산화를 조사하였다. 단백질 합성 억제제인 cycloheximide (CHX)가 함유된 배양액에서 24시간 배양한 1-세포 배아의 제핵된 세포질을 두 개의 전핵을 모두 가진 절반의 1-세포 배아와 재조합한 P+P-CHX군의 배아 발생과 유전자의 활성화는 P+P군의 배아와 유사하였으나, 밀집 형성과 밀집형성이 일어나는 세포 시기는 빨라져서 P+2군과 유사하였다. 또한 초기 배아의 발생 시 1-세포기에서 2-세포기 사이에 일어나는 단백질 인산화가 형태형성과정에 미치는 영향을 알아보기 위해, tyrosine protein kinase와 serine-threonine protein kinase의 억제제인 genistein (Gen)과 6-dimethylaminopurine (6-DMAP)이 처리된 배아의 제핵된 세포질과 2개의 전핵을 가진 절반의 1-세포 배아를 융합시킨 P+2-Gen과 P+2-DMAP군 배아의 발생과 밀집현상을 대조군인 P+P와 P+2군과 비교하였다. P+2-Gen과 P+2-DMAP군 배아에 발생은 대조군에 비해 빨랐으며, 특히 P+2-Gen군 배아는 밀집이 4-세포기에 일어나 8-세포기에 일어나는 P+2-DMAP군의 배아에 비해 일어나는 시간과 세포 시기가 빨라졌다. SDS-PAGE 방법으로 분석한 재조합 3시간째 P+2-Gen과 P+2-DMAP군의 단백질 인산화량은 대조군인 P+P와 P+2군에 비해 증가하였으나 종류의 변화는 없었다. 한편 2차원 전기영동법을 이용하여 P+2-DMAP군의 배아에서 P+2-Gen에 비해 80KD와 110KD 단백질의 인산화가 억제된다는 결과를 얻었다. 이상의 결과들은 생쥐의 초기 배아에서 형태 형성의 조절은 유전자 활성화 또는 난자내 모계 mRNA에 의해 수정 후 합성되는 새로운 단백질에 의한 것이 아니고, 난자내에 존재하는 인자에 의해 조절됨을 시사한다. 이 인자들 중 단백질의 인산화는 배아 발생과 형태형성에 밀접한 관계가 있으며, 특히 초기 1∼2세포기 사이에 serine-threonine protein kinase에 의해 인산화되는 단백질이 밀집현상을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제30권1호
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• pp.65-70
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• 2006

본 연구는 활성화처리 방법 및 배양 조건이 돼지 단위발생란의 체외발달 및 apoptosis에 미치는 영향을 알아보기 위해 실시되었다. 도축장 유래 난소로부터 채취된 미성숙 난자를 $42{\sim}44$시간 동안 성숙배양한 후 사용하였다. Apoptosis는 TUNEL 방법을 사용하여 조사하였다. 실험 1에서는 성숙배양된 난자들을 electric pulse(1.2 kV/cm for $30{\mu}sec$ 2회, E), E + 6-dimethylaminopurine(6-DMAP) 또는 E + cycloheximide(CH) 방법으로 활성화 처리하여 PZM-3를 이용하여 5% $CO_2,\;38.5^{\circ}C$에서 배양하였다. 실험 2에서는 전기자극을 이용하여 활성화처리된 난자들을 각각 PZM-3 또는 NCSU-23 배양액 내에서 배양하였다. 각 배양액 내의 난자들은 각각 20% $O_2$ 조건으로 나뉘어 배양하였다. E + 6-DMAP(36.5%) 또는 E + CH 구(32.5%)에서 E 구(27.7%)보다 유의적으로 높은 배반포 형성율을 보였다(P<0.05). 처리별 apoptosis 발생율은 각각 5.3%(E), 7.7%(6-DMAP) 및 7.1%(CH)였다. 실험 2에서는 PZM-3 구의 배반포 형성율이 NCSU-23 구에 비하여 산소분압조건과 관계없이 다소 높았다$(28.2{\sim}29.7%\;vs.\;22.6{\sim}24.4%)$. PZM-3 및 20% $O_2$ 조건하에서 유의적으로 낮은 apoptosis 발생 비율을 나타냈다(9.2%, P<0.05). 그러므로 돼지 단위발생란을 chemical agent를 이용한 추가 활성화처리 후 PZM-3, 20% $O_2$, 조건으로 배양하면 더 나은 배반포 발생율을 얻을 수 있다고 생각된다.

• 대한수의학회지
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• 제32권1호
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• pp.15-24
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• 1992

클로미펜 시트레이트가 배란반응, 난자의 형태, 난소 스테로이드 생성 및 수정란 발육에 미치는 영향을 PMSG 처리한 랫드에서 조사하였다. 먼저 세가지 용량(0.05mg, 0.1mg 및 1.0mg)의 클로미펜 시트레이트 또는 부형제를 미성숙의 Sprague Dawley 암컷에 일령 25일부터 27일까지 3일간 투여하였다. 그후 28일령에 이들 모든 암쥐에게 4IU PMSG를, 30일령에는 1.0mg 클로미펜 시트레이트가 처치된 일부의 암쥐에게 10IU hCG를 추가로 투여하였고, 31일령에 모두 도살하였다. 한편 4IU PMSG와 더불어 0.1mg클로미펜 시트레이트 또는 부형제를 투여한 일부의 암쥐는 숫쥐와 교미시킨 다음 임신 2일부터 5일까지 매일 도살하였다. 클로미펜 시트레이트의 용량을 증가시킴에 따라 배란반응(배란율 및 평균 배란난자의 수)과 난소중량이 대조군에 비하여 현저히 감소하였고 반면 배란난자의 변성율(%)은 그 용량에 비례하여 증가하였다. 클로미펜 시트레이트에 의한 배란반응 및 난소중량의 억제적 반응은 10IU hCG 추가투여에 의하여 완전히 대조군 수준으로 회복되었다. 그리고 클로미펜 시트레이트의 투여용량의 증가는 프로제스테론과 안드로젠의 혈장치 감소와 더불어 에스트라디올의 혈장치를 현저하게 증가시켰다. hCG의 추가투여는 이러한 클로미펜 시트레이트 작용에 의해 증가된 에스트라디올치를 현저하게 감소시키고 감소된 프로제스테론치를 증가시키는데 효과적이었다. 0.1mg의 클로미펜 시트레이트를 투여한 임신 랫드로부터 회수한 수정란은 전기간에 걸쳐 그 변성율(%)의 현저한 증가와 아울러 특히 임신 3일부터 그 수가 유의성있게 감소하였다. 클로미펜 시트레이트 투여에 의한 수정란의 난분할 속도도 임신 3일부터 대조군에 비하여 현저하게 지연되었으며 아울러 회수된 수정란의 난분할율(%)도 전기간에 걸처 대조군보다 지속적으로 저하되었다. 위의 결과는 흰쥐에 있어서의 클로미펜 시트레이트 투여에 의한 배란억제반응과 아울러 그 작용기전에 성선자극호르몬의 분비억제 또는 차단작용이 포함됨을 증명하였고 이 약제의 투여에 의한 난자의 형태적 정상성과 수정란발육에 대한 유해효과는 수정이전 시기에 있어서의 난소스테로이드 생성 특히 에스트라디올의 증가에 기인함을 제시한다.

• 한국가축번식학회지
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• 제24권4호
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• pp.407-417
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• 2000

본 연구는 태아 섬유아세포를 이용한 소 핵치환 난자의 융합에 있어서 여러 조건의 전기자극 처리 후 그에 따른 발달율을 조사하였다. 임선 45 일령 태아로부터 섬유아세포를 분리하여 3~4 차례 계대배양후, 이들 단일 섬유아 세포들을 미세조작기를 이용하여 제핵된 난자의 위란강 내에 주입하였다. 본 실험에서는 첫째로, 다른 전기자극 조건의 적용에 따른 융합율 및 발달율을 비교 조사하였다. 180 V/mm 의 조건하에서 다른 조건의 전기자극 시간 (15, 30, 45 $\mu$see)을 처리하였을 때, 15 (45.5%, 120/264)나 30 $\mu$see (43.9%, 106/241) 처리구가 45$\mu$see (23.2%, 58/250) 처리구 보다 높은 융합율을 나타내었다 (P＞0.05). 그러나, 융합된 난자의 발달율에 있어서는 처리구 간에 차이가 나타나지 않았다. 다음 실험으로, 핵치환 난자의 체외발달에 있어서 15 $\mu$see 의 전기자극 시간의 조건하에서 다른 전장 (1.5, 1.8, 2.1 kV/cm)에 따른 효과를 조사하였다. 핵치환 난자의 융합이나 발달율에 전장에 따른 차이는 나타나지 않았다 (P＞0.05). 마지막으로, 체세포 핵치환과 체외수정에 의한 수정란의 체외 발달율을 비교 조사하였다. 태아 섬유아세포로 재구성된 수정란의 배반포로의 발달율은 27.4% (75/274) 로 나타났으며, 이는 체외수정에 의해 발달한 배반포의 비율(24.5%, 58/237)과 유사하다는 것을 알 수 있었다. 그러나, 핵치환에 의해 유도된 배반포의 평균 세포 수는 체외수정에 의해 유도된 배반포 보다 낮게 나타났다. 결론적으로, 본 실험에서는 체세포로 핵치환된 소 난자의 전기적 융합에 대한 조건 (1.8 kV/cm, 15 $\mu$see)을 확립하였다. 또한, 본 실험에서 나타난 결과들은 체세포로 재구성된 소 난자들이 비록 체외수정에 의해 생산된 배반포보다는 적은 세포수를 보여주었지만, 체외에서 정상적으로 배반포 단계까지 발달할 수 있다는 것을 제시하고 있다.