In Vitro Development of Bovine Nuclear Transfer Embryos Reconstructed with Fetal Fibroblasts

태아 섬유아세포로 재구성된 핵치환 소 수정란의 체외발달

The present study was to examine effects of various electrical stimulus treatments used for electro-fusion on the preimplantation development of bovine nuclear transfer (NT) embryos with fetal fibroblast cells. Fetal fibroblast cells were isolated from one fetus at day 45 of gestation in Holstein cow, and passaged 3 to 4 times before being transferred into enucleated oocytes. Single fibroblast cells were individually placed into the perivitelline space of enucleated oocytes by using a micromanipulator. At first, the fusion and developmental rates of reconstructed oocytes were compared between different electric stimulation conditions. When fusion of the reconstructed oocyte was induced by different electric pulse periods (15, 30 and 45 $\mu$sec) at a DC pulse of 1.8 kV/cm, 15 (45.5%, 120/264) or 30 $\mu$ sec group (43.9%, 106/241) showed a higher fusion rate than 45 $\mu$sec group (23.2%, 58/250, P＜0.05). However, no difference was detected in the development rate of the fused oocytes to blastocysts between groups. Next experiment was to examine the effects of different electrical field strengths (1.5, 1.8 and 2.1 kV/cm) for 15 $\mu$sec at electrofusion on in vitro development of the NT embryos. As results, there was no difference in the fusion and developmental rates of the NT embryos between electrical strength (P＞0.05). Finally, developmental competence of bovine NT embryos with somatic cells was compared with IVF-derived embryos. Of enucleated oocytes fused with fibroblast cells, 27.4% (75/274) developed to the blastocyst stage, which is similar to that (24.5%, 58/237) of IVF-derived embryos. However, mean nuclei number of NT blastocysts was smaller than that of IVF-derived blastocysts. Thus, we have established an optimal condition (1.8 kV/cm, 15 $\mu$sec) for electric fusion of bovine NT oocytes with somatic cells. The present study indicates that bovine reconstructed embryos with somatic cells normally develop to blastocyst stage in vitro, although having smaller nuclei numbers of blastocysts as compared to IVF-derived embryos.

본 연구는 태아 섬유아세포를 이용한 소 핵치환 난자의 융합에 있어서 여러 조건의 전기자극 처리 후 그에 따른 발달율을 조사하였다. 임선 45 일령 태아로부터 섬유아세포를 분리하여 3~4 차례 계대배양후, 이들 단일 섬유아 세포들을 미세조작기를 이용하여 제핵된 난자의 위란강 내에 주입하였다. 본 실험에서는 첫째로, 다른 전기자극 조건의 적용에 따른 융합율 및 발달율을 비교 조사하였다. 180 V/mm 의 조건하에서 다른 조건의 전기자극 시간 (15, 30, 45 $\mu$see)을 처리하였을 때, 15 (45.5%, 120/264)나 30 $\mu$see (43.9%, 106/241) 처리구가 45$\mu$see (23.2%, 58/250) 처리구 보다 높은 융합율을 나타내었다 (P＞0.05). 그러나, 융합된 난자의 발달율에 있어서는 처리구 간에 차이가 나타나지 않았다. 다음 실험으로, 핵치환 난자의 체외발달에 있어서 15 $\mu$see 의 전기자극 시간의 조건하에서 다른 전장 (1.5, 1.8, 2.1 kV/cm)에 따른 효과를 조사하였다. 핵치환 난자의 융합이나 발달율에 전장에 따른 차이는 나타나지 않았다 (P＞0.05). 마지막으로, 체세포 핵치환과 체외수정에 의한 수정란의 체외 발달율을 비교 조사하였다. 태아 섬유아세포로 재구성된 수정란의 배반포로의 발달율은 27.4% (75/274) 로 나타났으며, 이는 체외수정에 의해 발달한 배반포의 비율(24.5%, 58/237)과 유사하다는 것을 알 수 있었다. 그러나, 핵치환에 의해 유도된 배반포의 평균 세포 수는 체외수정에 의해 유도된 배반포 보다 낮게 나타났다. 결론적으로, 본 실험에서는 체세포로 핵치환된 소 난자의 전기적 융합에 대한 조건 (1.8 kV/cm, 15 $\mu$see)을 확립하였다. 또한, 본 실험에서 나타난 결과들은 체세포로 재구성된 소 난자들이 비록 체외수정에 의해 생산된 배반포보다는 적은 세포수를 보여주었지만, 체외에서 정상적으로 배반포 단계까지 발달할 수 있다는 것을 제시하고 있다.