• 한국수정란이식학회지
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• 제19권3호
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• pp.265-273
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• 2004

본 연구는 mNCSU-23에서 체외성숙시킨 난자를 이용하여 돼지 체외수정시 적절한 배양액과 정자농도를 구명하고자 수행하였다. 정액은 액상정액을 이용하였고 체외수정배양액으로 mTBM과 mTLP-PVA, 정자농도는 운동정자수 5${\times}$$10^4$, 1${\times}$$10^{5}$ , 5${\times}$$10^{5}$ sperm/$m\ell$로 체외수정 한 다음 NCSU-23에서 체외발달을 유도한 결과는 다음과 같다. 1. 돼지 체외성숙란을 mTBM 또는 mTLP-PVA에서 운동정자수 1${\times}$$10^{5}$ sperm/$m\ell$로 체외수정시킨 다음 체외발달시킨 결과, 정자침투율, 웅성전핵형성율, 다정자수정발생율, 난분할율, 배반포 발달율 등 어느 것도 두 배양액간 차이를 나타내지 않았다. 2. 체외성숙란을 mTBM에서 운동정자수 5${\times}$$10^4$, 1${\times}$$10^{5}$ , 5${\times}$$10^{5}$ sperm/$m\ell$l로 체외수정시킨 다음 체외발달시킨 결과, 정자침투율, 웅성전 핵형성율, 다정자수정발생율 등은 모두 정자 농도간 유의적인 차이를 보였고(P<0.05), 난 분할율과 배 반포발달율은 5${\times}$$10^4$이 1${\times}$$10^{5}$ , 5${\times}$$10^{5}$ sperm/$m\ell$보다 유의 적으로 낮았으나(P<0.01), 1${\times}$$10^{5}$ 와 5${\times}$$10^{5}$ sperm/$m\ell$ 간에는 차이가 없었다. 따라서, 액상정액을 이용한 돼지 체외성숙란의 체외수정배양액으로 mTBM과 mTLP-PVA간 차이는 없으며, mTBM에서 체외수정시킬 때 정자농도는 운동정자수로 1${\times}$$10^{5}$ sperm/$m\ell$가 적절할 것으로 사료된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제25권1호
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• pp.1-7
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• 2010

The objective of this study was to examine the effect of vitamin B (pantothenic acid, folic acid, and myo-inositol) that was supplemented to embryo culture medium on in vitro development of parthenogenetically activated (PA) pig embryos. Cumulus-oocyte complexes derived from slaughtered ovaries were matured in TCM-199 supplemented with porcine follicular fluid, cysteine, pyruvate, EGF, insulin, and hormones (hCG and eCG) for the first 22 h and then further cultured in hormone-free medium for an additional 22 h. After maturation culture, metaphase II oocytes that extruded 1st polar body were electrically activated and treated with $5.0\;{\mu}g/ml$ cytochalasin B for 4 h. Then, PA embryos were cultured for 7 days in a modified NCSU-23 that was supplemented with pantothenic acid, myo-inositol, or folic acid at different concentrations ($3{\sim}300\;{\mu}M$) according to the experimental design. Myo-inositol added to culture medium did not show any beneficial or inhibitory effects on embryo cleavage and blastocyst formation. However, $300\;{\mu}M$ pantothenic acid significantly inhibited blastocyst formation compared to control (no addition) (24% vs. 36%, p<0.05). Folic acid ($300\;{\mu}M$) significantly (p<0.05) increased blastocyst formation (56%) compared to control (41%). Our results demonstrated that in vitro development of PA embryos was significantly influenced by vitamin B and addition of $300\;{\mu}M$ folic acid to culture medium improved in vitro development of pig PA embryos.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.42-42
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• 2001

The objective of this study was to assess the development of porcine follicular oocytes fertilized by ICSI. Cumulus-oocyte-complexes (COCs) were collected by aspiration from follicles of 2-7 mm in diameter from a local slaughterhouse ovaries. Oocytes matured for 40-44 h were centrifuged at 12,000g for 6 min and then injected with sperm prepared by swim-up procedure in the presence or absence of 5 mM dithiothreitol (DTT). Injected oocytes were cultured in NCSU 23 medium during 6 to 8 days. IVF controls were compared to those of resulting embryos. The results obtained were as. follow: 1, The rates of cleavage and development rates into blastocyst by ICSI were not significantly (P<0.05) different between with (53.0% and 19.7%) or without (48.3% and 23.8%) centrifugation, respectively. 2. The cleavage and developmental rates to blastocyst after ICSI with or without 5mM DTT treated-sperm were not significantly (P<0.05) different (60.4% vs 16.4% and 48.5% vs 22.2%, respectively). 3. The cleavage and the developmental rates to blastocyst were not significantly (P<0.05) different between the zygotes obtained by IVF (51.8% vs. 22.4%) and ICSI (51.4% vs. 21.6%). 4. The number of blastomere in blastocyst stages after IVF or ICSI was not significantly different (46.7 $\pm$2.9 and 41.9$\pm$4.6).

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제34권1호
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• pp.55-62
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• 2010

Matrix metalloproteinases (MMP) play important roles in extracellular matrix (ECM) remodeling during ovarian follicular development, oocytes development and ovulation. In an attempt to investigate the effect of MMP activation in development cumulus-oocytes complexes, we examined the localization and expression of MMP, and monitored MMP expression profile. Cumulus-oocytes complexes were collected and matured in vitro for 24 hr, 36 hr and 48 hr. A mRNA expression of MMP-2, MMP-9, TIMP-2 and TIMP-3 was detected in all culture medium regardless of CC, DC and CDCs. Activity of MMP-2 in the DC progressively was increased from 24 hr to 48 hr. But MMP-9 was not detected in all culture medium. The localization of MMP-2 was also measured by immunohistochemistry analysis. The MMP-2 and TIMP-2 was detected in cumulus cell and oocyte zone pellucida. Expression of MMP-2 protein in the COCs was progressively increased from 24 hr to 48 hr. However, MMP-9 protein was progressively decreased from 24 hr to 48 hr. And TIMP-2 protein was most highly expressed in the CDCs 36 hr. Expression of TIMP-3 protein in the CDCs was progressively increased from 24 hr to 48 hr. In conclusion, these results suggest that MMP-2 plays a role in maintaining normal maturation and development by controlling the ECM inhibitor concentration on cumulus cell and oocytes.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제29권3호
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• pp.169-174
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• 2005

본 연구는 배양액의 종류에 따른 돼지 난자의 성숙 및 단위발생란의 배반포 형성율을 검토하였으며, 배양액의 삼투압과 발달 시기에 따른 배양액의 삼투압 변화가 돼지 단위발생란의 발달에 미치는 영향을 검토하였다. 실험 1에서 난포란을 NCSU-23 mWM 및 mKRB에 각각 성숙배양한 결과 성숙률은 $62.1\~71.3\%$로 배양액에 따른 차이가 없었다. 실험 2에서는 각각의 배양액으로 성숙된 난자를 활성화 처리 후 동일한 배양액으로 6일간 배양하여 발달율을 검토한 결과, 배반포 발육율은 NCSU-23에 배양 시 $22.9\%$로 타 그룹($0\~0.6\%$)보다 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 실험 3에서는 단위발생란을 NaCl 안에 의해 256, 280 및 300 mOsmol(mOsm)로 조정한 NCSU-23에 6일간 배양한 결과, 배반포 발육율은 $11.0\~14.4\%$로 실험군 간에 유의적인 차이는 없었으나 삼투압이 낮을수록 난자의 fragment 비율이 높게 나타났다(P<0.05). 실험 4에서는 단위발생란을 삼투압이 조정된 세 종류의 NCSU-23에 48시간 배양한 후 삼투압이 높거나 낮은 NCSU-23으로 옮겨 4일간 추가 배양한 결과 배반포 형성율은 배양 48시간 후에 배양액의 삼투압을 낮춰 주었을 때($21.0\%$)가 높여 주었을 때 ($11.8\%$) 보다 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).본 실험의 결과는 돼지 단위발생란의 발육이 배양액의 종류 및 삼투압에 의해 영향을 받으며, 배양액의 삼투압은 돼지 단위발생란의 발육 단계별로 영향을 주어, 초기에는 높은 삼투압의 배양액에서 배양하고 일정 시간 후 낮은 삼투압의 배양액으로 배양함으로써 발육이 증진될 수 있음을 시사한다.

• 한국가축번식학회지
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• 제22권2호
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• pp.187-194
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• 1998

본 연구는 돼지 수정란의 동결에 있어서 내동제의 종류, sucrose 농도, 평형시간 및 융해온도가 생존율에 미치는 영향과 미성숙 난자의 체외배양과 동결융해 후 생존율과 체외수정율을 조사하고저 수행하였다. 1. 수정란의 급속동결에 있어서 1.5 M glycerol, 2.0 M DMSO, 2.5 M ethyleneglycol 및 2.0 M propanediol 농도에서 생존율이 유의하게 높았으며, 내동제에 첨가된 sucrose농도는 0.25 M 첨가가 다른 농도에 비해 생존율이 높게 나타났다. 동결수정란은 3$0^{\circ}C$에서 융해시 생존율은 33.3~40.6%로서 $25^{\circ}C$ 및 37$^{\circ}C$의 융해온도에 비해 높게 나타났으며, 동결시 1.5 M 및 2.0 M glycerol＋0.25 M sucrose가 첨가된 내동액으로 짧은 평형시간(2.0~5.0분)이 긴 평형시간 (10~15분)보다 높은 생존율을 나타냈다. 2. 미성숙란을 1~8시간 체외배양시킨 다음 동결융해 후 체외수정시켰을 때 수정율은 6.7~26.7%로서 단시간의 체외성숙 배양이 높게 나타났으며, 또한 체외배양시 생존율은 10.0~30.0%를 나타냈다.

• 농업과학연구
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• 제26권2호
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• pp.19-24
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• 1999

본 실험은 배지 및 호르몬이 돼지 난포란의 체외성숙 및 체외발생능에 미치는 영향을 구명하기 위하여 실시하였다. 기본 배지는 TCM-199, Waymouth MB751/1 및 BMOC-II를 사용하였으며, 각각의 배지에 첨가된 호르몬은 hCG와 FSH를 사용하였다. 실험에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. TCM-199을 기본배양액으로 하여 돼지난포란을 체외배양하였을 때, 체외성숙률은 배양액내에 hCG 단독첨가의 경우가 78.05%, FSH 단독첨가에서 72.50%, hCG와 FSH의 병용첨가의 경우가 67.50%로서 호르몬을 첨가하지 않은 처리구의 54.29%에 비하여 유의적(P<0.05)으로 높은 성적을 나타냈으며, 수정후 같은 배지조건하에서 난할률은 호르몬 첨가의 경우(hCG 46.88%, FSH 31.04%, hCG+FSH 37.04%)가 무첨가구(89.47%)에 비하여 유의적(P<0.05)으로 낮았다. 2. Waymouth MB751/1을 배양액으로 하여 체외배양하였을 때, 체외성숙률은 배양액내에 hCG가 71.43%, hCG+FSH 병용첨가의 경우가 80.00%로서 호르몬을 첨가하지 않은 처리구의 25.64%에 비하여 유의적(P<0.05)으로 높은 성적을 나타냈다. 그러나, 난할률은 호르몬 첨가의 경우(hCG 46.67%, FSH 36.00%, hCG+FSH 35.71%)가 무첨가구(60.00%)에 비하여 낮은 성적을 나타냈다. 3. BMOC-II를 기본배양액으로 하여 체외배양 하였을 때, 체외성숙률은 배양액내에 hCG 단독첨가 66.7%, FSH 단독첨가 91.89%, hCG+FSH 병용첨가 81.82% 및 무첨가구 66.67%로 각각 나타나서 FSH 단독첨가의 경우가 가장 높은 성적을 나타냈다. 또한, 난할률은 hCG 단독첨가 79.17%, FSH 단독첨가 50.00%, hCG_FSH 병용첨가 66.67% 및 무첨가 81.82%로 각각 나타났다.

• Current Research on Agriculture and Life Sciences
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• 제8권
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• pp.45-50
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• 1990

본 실험은 성선(性腺)자극호르몬과 우태아혈청(牛胎兒血淸) 첨가가 돼지 난포란(卵胞卵)의 체외성숙(體外成熟) 및 체외수정(體外受精)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다. 미경산돈(未經産豚)(체중 80~90kg)의 난소(卵巢)를 도살된 직후에 절취하여 $37{\sim}39^{\circ}C$의 보온병에 담아 실험실로 운반하여 난포(卵胞)직경이 3~5mm되는 것만을 골라 난포(卵胞)를 찔러서 난포란(卵胞卵)을 채취하였다. 성숙모돈(成熟牡豚)(체중 130~150kg)의 정소상체미부정자(精巢上體尾部精子)를 $4{\times}10^8cells/m{\ell}$ 농도로 희석하여 체외수정(體外受精)에 이용하였다. 본 실험의 경과를 요약하면 다음과 같다. 1. m-KRB와 10% FCS를 m-KRB에 첨가한 경우 성숙율(成熟率)은 82.37%이며, 10% FCS가 첨가된 배양액에 PMSG, hCG 그리고 PMSG와 hCG를 각각 $10IU/m{\ell}$ 첨가한 경우 66, 58, 68%로서 성숙율(成熟率)이 향상되었다. 2. 난구세포(卵丘細胞)의 팽화(膨化)는 m-KRB와 10% FCS가 첨가된 배양액에서 일어나지 않았으나 10% FCS가 첨가된 배양액에 PMSG, hCG 그리고 PMSG와 hCG를 각각 $10IU/m{\ell}$ 첨가시 92, 13, 91%로서 팽화율(膨化率)이 향상되었다. 3. m-KRB에서 성숙된 난포란(卵胞卵)의 체외수정(體外受精)에서 정자침입율과 웅성전핵(雄性前核) 형성율은 각각 93.7%였으나 FCS와 성선(性腺)자극호르몬을 첨가한 경우 각각 100, 80%로서 웅성전핵(雄性前核) 형성율이 향상되었다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제22권1호
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• pp.1-7
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• 2007

본 연구는 체외 성숙된 난자와 동결 융해 정자를 이용한 돼지의 체외 수정 과정에서 난구 세포의 존재가 정자 침투율, 웅성전핵 형성률 그리고 후기배로의 체외 발육에 미치는 영향을 알아보기 위하여 수행되었다. 돼지 난소로부터 난자-난구세포 복합체를 채취하여 eCG/hCG, 10% 돼지 난포액, epidermal growth factor 등이 첨가된 TCM 199 배양액에서 44시간 배양하여 체외 성숙을 유도하였다. 성숙 배양 후 난구 세포를 제거한 난자와 난구 세포가 부착되어 있는 난자를 돼지 동결 융해정액을 이용하여 5mM caffeine과 10mM calcium chloride를 함유한 mTBM배양액에서 8시간 체외 수정하였다. 체외 수정 후 난자를 고정, 염색하여 정자 침투율과 웅성전핵 형성률을 조사하였고(실험 $1{\sim}3$) 일부 수정란을 North Carolina State University-23 배양액에서 체외 수정 후 156시간 배양하여 후기배로의 발육능을 검토하였다(실험 3). 실험 1에서는 정자 농도를 $7.5{\times}10^5/ml$로 조정하여 나화 난자와 난구 세포 부착난자에서 정자 침투율 및 웅성전핵 형성률을 조사하였다. 실험 2에서는 난구 세포 부착 난자의 체외 수정에 적합한 정자 농도를 구하기 위해 2, 3, 4, 및 $5{\times}10^6/ml$의 농도로 난자를 수정한 후 정자 침투율 및 웅성전핵 형성률을 조사하였다. 실험 3에서는 나화 난자 및 난구 세포 부착 난자를 각각 $7.5{\times}10^5/ml$의 정자 농도로 체외 수정한 후 후기배로의 발육률을 조사하였다. 실험 1의 결과 정자 침투율은 나화 난자에 비해 난구 세포 부착 난자에서 유의적으로 감소되었다(35.2% vs. 77.4%; p<0.01). 실험 2에서 다양한 정자 농도에 의한 정자 침투율과 정상 수정률을 바탕으로 판단했을 때 $4.6{\times}10^6/ml$의 정자 농도가 다른 정자 농도에 비해 난구 세포부착 난자의 체외 수정에 적합한 것으로 나타났다. 체외 수정과정에서 난구 세포 부착된 상태로 수정된 난자는 나화 난자에 비해 유의적으로(p<0.05) 높은 분할률(48.8% vs. 58.9%), 배반포 형성률(11.0% vs. 22.8%)과 배반포 세포수$(22{\pm}2\;vs.\;29{\pm}2)$를 나타내었다. 본 연구의 결과로부터 돼지의 체외 수정과정에서 난구 세포의 존재는 정자 침투를 저해하지만 분할률, 배반포 형성률 및 배반포의 세포수를 증가시키는 것으로 사료된다.