An antioxidant peptide derived from Pinctada fucata meat using an Alcalase2.4L enzymatic hydrolysis method (named AOP) and identified by LC-TOF-MS has promising clinical potential for generating cosmetic products that protect skin from sunshine. To date, there have been few published studies investigating the structure-activity relationship in these peptides. To prepare antioxidant peptides better and improve their stability, the design and expression of an antioxidant peptide from Pinctada fucata (named DSAOP) was studied. The peptide contains a common precursor of an expression vector containing an ${\alpha}$-helix tandemly linked according to the BamHI restriction sites. The DNA fragments encoding DSAOP were synthesized and subcloned into the expression vector pET-30a (+), and the peptide was expressed mostly as soluble protein in recombinant Escherichia coli. Meanwhile, the DPPH radical scavenging activity, superoxide radical scavenging activity, and hydroxyl radical scavenging activity of DSAOP $IC_{50}$ values were $0.136{\pm}0.006$, $0.625{\pm}0.025$, and $0.306{\pm}0.015mg/ml$, respectively, with 2-fold higher DPPH radical scavenging activity compared with chemosynthesized AOP (p < 0.05), as well as higher superoxide radical scavenging activity compared with natural AOP (p < 0.05). This preparation method was at the international advanced level. Furthermore, pilot-scale production results showed that DSAOP was expressed successfully in fermenter cultures, which indicated that the design strategy and expression methods would be useful for obtaining substantial amounts of stable peptides at low costs. These results showed that DSAOP produced with recombinant Escherichia coli could be useful in cosmetic skin care products, health foods, and pharmaceuticals.
제 3위 소화액 채취기법은 기존 반추위 영양생리 대사 패턴 측정방법인 in vivo, in vitro 및 in situ 방법의 단점을 극복하고 정확한 반추위 생리대사 패턴의 측정을 할 수 있는 기회를 가진다. 이 제 3위 소화액 채취기법을 이용한 측정방법은 기존의 post-ruminal sampling 기법과 비교해서 다음과 같은 장점들이 존재한다. 1) 단지 반추위캐뉼라가 설치된 동물만이 필요하며, 2) 제 3위 소화액에는 비교적 적은 내인성 질소가 존재하며, 3) 제 3위 소화액은 제 4위에서 시작되는 소화효소에 의한 소화를 피할 수 있는 점 등이다. 제 3위 소화액 내 반추위 미분해 용해성 질소화합물(SNAN)의 측정은 in situ 방법의 전제조건인 반추위에서 rapidly degradable N은 무한정 분해되며 따라서 비용해성 사료 N 만이 반추위를 벗어난다는 것이 오류임을 보여준다. 제 3위 소화액 내 SNAN 중 유리아미노산 및 용해성 단백질과 비교해서 양적으로 가장 많은 peptide는 반추위 단백질대사에서 peptide에서 아미노산으로의 분해과정이 분해율 제한요인이 될 수 있음을 시사한다.
최근 염분의 섭취와 관련하여 건강에 대한 우려가 늘어남에 따라, 염미대체제에 대한 소비자들의 관심이 급증하고 있으며, 세계적으로 경쟁력 있는 천연 저염제품의 개발이 필요한 실정이다. 최근 연구를 통해 식물성 및 동물성 원료 배합을 통해 가수분해물을 조제하여 최적 화합물을 얻는 것에 성공하였다. 본 연구에서는 염미성 펩타이드 분말내 arginine을 함유한 염미성 펩타이드를 규명하고 정량 하고자 하였다. L-arginine 또는 arginine을 포함한 펩타이드를 표준물질로 하여 $^{13}C$-NMR로 분석한 결과 유사한 위치에 구아니딘기 탄소가 시그널(L-arginine: 156.8 ppm, Arg-Ala: 156.4 ppm, Arg-Ser: 156.4 ppm)이 나타남을 확인하였고, 이를 통해 간편하고 신속하게 arginine 함유 펩타이드 정량분석이 가능할 것으로 기대된다.
밀 단백질에 효소가수분해 할 때 생산되는 peptide의 항균활성과 천연항균제로서의 이용가능성을 검토하기 위하여 실험을 행하였다. 밀 단백질에 7종의 단백질가수분해효소를 작용시켜 생성된 가수분해물의 항균활성을 측정하고 한외여과, membrane filtration, HPLC를 이용하여 항균성 peptide를 분리 정제한 후 분자량과 아미노산 결합순서를 측정한 결과는 다음과 같다. 밀 단백질에 7종의 단백질 분해효소를 적용시켜 제조한 가수분해물중 Asp. saito protease를 적용시켜 얻어진 peptide 만이 항균활성을 나타내었다. Asp. saito protease는 $37^{\circ}C$, pH 6.0에서 작용시킨 경우에 항균활성이 가장 높았으며, $50^{\circ}C$ 이상에서는 활성을 나타내지 않았다. 밀단백 효소가수분해물은 membrane filtration에 의하여 분자량 1,000~3,000 에서 항균활성이 나타났다. Membrane filtration으로 얻어진 항균활성분획을 HPLC로 분리한 결과 retention time 31.1~31.8 min에서 항균활성을 나타내었다. 밀단백 효소가수분해물은 $121^{\circ}C$에서 15분간 가열하여도 효소활성이 유지되는 매우 안정한 화합물이었다. 항균활성분획을 MALDI-mass로 질량을 분석한 결과 1,633이었다. 항균성 peptide의 아미노산 결합순서는 cysteine, glycine, prolin, prolin, prolin, valine, valine, alanine, alanine, arginine 의 순서였다.
본 연구는 단백질분해효소로 whey protein을 가수분해하여 얻은 가수분해물의 용해도와 유화특성의 변화를 측정하기 위해 실시하였다. Whey protein concentrates를 porcine trypsin(E : S=1 ; 3,000)으로 pH 8.0, 37$^{\circ}C$에서 6시간 동안 가수분해한 whey protein 가수분해물의 유화활성은 분해 4시간째에 가장 높게 나타났으며, 이 때 가수분해도는 5.50%이었다. whey protein의 효소가수분해로 whey protein 중의 $\alpha$-lactalbumin은 분해가 잘 일어나지 않으나 $\beta$-lactoglobulin은 분해 초기부터 급속히 분해되며 유화력 상승에 관여하는 여 러개의 저분자량 peptide를 생성하였다. 가수분해물의 용해도는 가수분해시간이 지남에 따라 증가세를 보이다가 5시간부터 조금씩 감소 추세를 보였으며, pH에 따라서는 등전점 부근인 pH4~5에서 용해도가 가장 낮았으나 가수분해시간이 증가함에 따라 이 부근의 용해도가 현저히 증가하였으며 pH 6이상에서는 pH가 증가함에 따라 용해도도 증가하였다. 유화활성은 용해도의 결과와 거의 비슷한 결과를 나타내었다. 유화 안정성은 분해시간이 지남에 따라 조금씩 증가함을 보여주었으나, 가수분해 4시간부터 pH 8 이상의 PH에서 급격한 증자를 나타내었다.
연산오계는 오래전부터 건강기능 증진 및 치료 효능이 높은 것으로 알려져 왔다. 최근 건강기능식품 소재로 기능성 펩타이드 효능이 알려짐에 따라, 연산오계 다리육으로부 올리고 펩타이드 최적 생산 공정 및 생성물 특성에 대하여 연구를 수행하였다. 최적 효소가수 분해 공정 표면반응 분석을 이용하여 수행하였다. 최적 공정 조건을 확립하기 위해서 온도 (40, 50, $60^{\circ}C$), pH (pH 6.0, 7.0, 8.0), 효소 (1, 2, 3%) 범위에서 수행을 하였다. 생성물에 대한 가수분해도, 유리아미노산, 분자량 분포를 분석하였다. 효소 가수분해 최적 온도는 $58^{\circ}C$, pH 7.5, 효소의 농도는 3% 이었다. 최적 조건에서 2 시간 효소 가수분해를 한 결과 75-80% 이었다. 유리 아미노산 총량은 168.131 mg/100 g 이었다. 분자량를 MALDI-TOF 으로 분석을 한 결과 90% 이상이 300-1,000 Da 분포를 보여주었다.
Portage kinetic constants of peptide transport can be measured by competitive spectrophotometry. The kinetic constants of L-Glu-L-Glu transport in Escherichia coli were ascertained using L-Phe-L-3-thia-Phe (PSP) as a detector. Since the production of thiophenol upon intracellular hydrolysis of PSP was competitively inhibited by L-Glu-L-Glu, it was able to compute the kinetic constants of L-Glu-L-Glu using this method. The resulted data were in agreement with the values obtained by the method of Michaelis-Menten kinetics. The potential of this method was examined against dipeptide transport systems in various microorganisms. These results strongly suggest that the overall properties of individual systems for dipeptide transports can be easily characterized by competitive spectrophotometry.
한국미생물생명공학회 2001년도 Proceedings of 2001 International Symposium
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pp.40-45
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2001
Raw starch-digesting amylase (BF-2A, M.W. 93, 000 Da) from Bacillus circulans F-2 was converted to two components during digestion with subtilisin. Two components were separated and designated as BF-2A' (63, 000 Da) and BF-2B (30, 000 Da), respectively. BF-2A' exhibited the same hydrolysis curve for soluble starch as the original amylase (BF-2A). Moreover, the catalytic activities of original and modified enzymes were indistinguishable in $K_{m}$, Vmax for, and in their specific activity for soluble starch hydrolysis. However, its adsorbability and digestibility on raw starch was greatly decreased. Furthermore, the enzymatic action pattern on soluble starch was greatly different from that of the BF-2A. A smaller peptide (BF-2B) showed adsorb ability onto raw starch. By these results, it is suggested that the larger peptide (BF-2A') has a region responsible for the expression of the enzyme activity to hydrolyze soluble substrate, and the smaller peptide (BF-2B) plays a role on raw starch adsorption. A similar phenomenon is observed during limited proteinase K, thermolysin, and endopeptidase Glu-C proteolysis of the enzyme. Fragments resulting from proteolysis were characterized by immunoblotting with anti-RSDA. The proteolytic patterns resulting from proteinase K and subtilisin were the same, producing 63- and 30-kDa fragments. Similar patterns were obtained with endopeptidase Glu-C or thermolysin. All proteolytic digests contained a common, major 63-kDa fragment. Inactivation of RSDA activity results from splitting off the C-terminal domain. Hence, it seems probable that the protease sensitive locus is in a hinge region susceptible to cleavage. Extracellular enzymes immunoreactive toward anti-RSDA were detected through whole bacterial cultivation. Proteins of sizes 93-, 75-, 63-, 55-, 38-, and 31-kDa were immunologically identical to RSDA. Of these, the 75-kDa and 63-kDa proteins correspond to the major products of proteolysis with Glu-C and thermolysin. These results postulated that enzyme heterogeneity of the raw starch-hydrolysis system might arise from the endogeneous proteolytic activity of the bacterium. Truncated forms of rsda, in which the gene sequence encoding the conserved domain had been deleted, directed the synthesis of a functional amylase that did not bind to raw starch. This indicates that the conserved region of RSDA constitutes a raw starch-binding domain, which is distinct from the active centre. The possible role of this substrate-binding region is discussed.d.
대두단백 가수분해 산물의 맛과 향을 개선하기 위해 효소에 의한 가수분해 system을 확립하기 위하여 단백질 가수분해 패턴이 서로 다른 효소로 생산된 단백 분해산물의 가수분해도와 표면 소수도 등을 측정하였다. 이들 분해물의 pattern을 SDS 전기영동으로 조사하였고, 효소반응에 의한 단백질분해물의 관능검사를 실시하였다. 각 균주가 생산한 단백질 분해효소의 pH 변화에 따른 효소의 활성은 No. 16 효소(Bacillu megarerium Bl6)와 No. 4효소(Aspergillus oryzae M4)는 pH 7.0에서 No. 95효소(Bacillu subtilis YG 95)와 No. 5효소(Mucor circinelloides M5)는 8.0에서 가장 높은 효소반응 활성을 보였다. 또한 반응온도에 따른 효소활성의 크기는 4가지 효소 모두 45$^{\circ}C$에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 대두단백질 분해물의 SDS 전기영동 pattern변화에서, Bacillus megaterium Bl6과 Mucor circinelloides M5의 효소 (No. 16, No. 5)는 반응 후 분자량이 비교적 큰 peptide가 많이 생성되었으며, 효소반응 3시간 경과 후에도 분자량 66KD의 peptide를 확인할 수 있었다. 반면에 Bacillus subtilis YG 95와 Aspergillus oryzae M4의 효소(No. 95, No. 4)는 분자량 15KD∼45KD 미만의 작은 분자량의 peptide 물질이 주로 생성되었으며, 반응 2시간 경과후에는 30KD 미만의 저분자 Peptide가 주로 생성되었다. 이와 같은 결과는 HPLC 분석 결과와 일치하였다. 가수분해가 진행됨에 따라서 SDS 표면소수도가 크게 저하되었으며, Aspergillus oryzae M4 효소의 분해물의 가수분해도가 가장 높았다. 관능검사 결과, No. 4(Aspergillus oryzae M4)와 No. 95(Bacillus subtilis YG 95) 가 강한 쓴맛을 나타내었다. 각각의 효소들을 조합해서 분해한 단백분해물을 관능검사한 결과, Aspergillus oryzae M4 효소와 조합된 것의 대두단백질 분해물이 비교적 강한 쓴맛을 나타내었다. 분해물의 단맛은 시료별로 큰 차이가 나타나지 않았으나 Bacillu megarerium Bl6과 Aspergillus oryzae M4를 조합하였을 때 상대적으로 단맛의 정도가 높게 나타났다. 따라서 이와 같은 효소특성을 이용하여 대두단백질을 가수분해를 하였을 때 다양한 단백질 분해물의 제조에 이용이 가능할 것으로 사료된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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