• 대한임상검사과학회지
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• 제47권2호
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• pp.83-89
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• 2015

결핵(Mycobacterium tuberculosis, MTB) 감염은 아직까지 전 세계에서 높은 유병률과 사망의 주요 원인이 되고 있으며 비정형 결핵(nontuberculous mycobacteria, NTM)은 최근 후천성 면역결핍증(AIDS)이나, 종양, 이식 등으로 면역력이 저하된 환자들의 임상 검체에서 분리빈도가 증가함에 따라 분리 균주의 임상적 의의가 중요시 되고 있다. 이에 항산균 염색을 이용한 객담 도말검사는 결핵균과 비정형 결핵균을 구별할 수 없다는 제한점이 있고, 균 분리배양검사는 시간이 오래 걸린다는 단점이 있어, 본 연구에서는 이러한 제한점을 가진 기존의 검사법을 대신하여 분자생물학적 방법인 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 균 분리배양 검사와 비교하여 보았다. Mycobacteria를 동정하는데 항산균 염색과 3% ogawa 배지를 이용하였고, 균 분리배양 후 M. tuberculosis를 확인하기 위해서 niacin test를 실시한 결과 집락의 DNA를 추출하여 PCR후 동정된 M. tuberculosis와 niacin 양성이 일치함을 확인할 수 있었다. 또, 이 실험에서 항산성균 염색이 2+ 이상인 객담검체와 집락검체 각각에서 DNA를 추출하여 결핵균을 동정하는 방법으로 M. tuberculosis complex에 특징적으로 존재하는 insertion sequence (IS) 6110의 특정부위인 547 bp와 285 bp 부분을 증폭한 two-tube nested polymerase chain reaction을 시행하였고, 비정형 결핵균 동정법으로는 mycobacteria에 공통적으로 존재하는 rpoB 유전자 중 일부인 360 bp 부분을 증폭한 후, 제한효소 Msp I을 첨가 PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP)을 시행하였으며, 결핵균과 비정형 결핵균 모두 동정율에 거의 차이가 없었다. 1+인 경우는 객담검체에서 PCR한 결과가 31.2%에서 집락검체의 PCR한 결과 93.7%까지 결핵균과 비정형결핵균의 동정율이 높아졌고, trace인 경우 객담검체에서 PCR 결과가 2%에서 집락검체에서 PCR한 결과가 97.9%까지 결핵균과 비정형 결핵균의 동정율을 높일 수 있었다. 이 실험에서 항산성균 염색 1+이하 일때 객담검체와 집락검체로 PCR을 실시하면 결핵균과 비정형 결핵균의 동정율에 차이가 있고, 배양만으로는 결핵균의 동정은 가능하지만 비정형 결핵균의 동정이 가능하지 않으므로 배양검사와 PCR 검사 모두를 병행하므로써 보다 신속하고 정확한 검사결과를 내는데 도움 될 것이다.

• 치위생과학회지
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• 제9권2호
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• pp.249-255
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• 2009

본 연구는 성인성 치주염 환자의 치은연하 치면세균막을 총 60개 치아에서 채취하여 F. nucleatum과 A. actinomycetemcomitans의 동정을 위해 세균배양법, single PCR법 및 mutliplex PCR법을 실시하였고, 세균 동정법간의 비교를 통해 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. F. nucleatum과 A. actinomycetemcomitans의 동정을 위해 세균배양법, single PCR 및 multiplex PCR을 실시한 결과 F. nucleatum은 각각 12개(20.0%), 45개(75.0%), 43개(71.7%) 치아에서 양성반응을 보였지만, A. actinomycetemcomitans는 각각 0개(0.0%), 4개(6.7%), 1개(1.7%) 치아에서 양성반응이 나타났다. 2. F. nucleatum은 세균배양법에 비해 single PCR법 및 multiplex PCR법에서 높은 검출 빈도를 보여 좀 더 효율적인 세균 동정법으로 생각되었지만, 통계적으로는 유의한 차이가 없었다. 3. A. actinomycetemcomitans는 세균배양법에서 전혀 검출되지 않아 통계적으로 검정할 수 없었고, 세균 동정법간의 비교도 어려웠다. 4. F. nucleatum과 A. actinomycetemcomitans의 동정을 위한 single PCR법과 multiplex PCR법 간의 비교에서 두 세균 모두 검출 빈도에 있어서는 큰 차이를 보이지 않았지만, 통계적으로는 유의한 차이를 보였다.

• KSBB Journal
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• 제19권1호
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• pp.72-77
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• 2004

건강에 대한 관심의 증대로 인한 저염식품의 개발 필요성에 맞추어 오이발효에 염의 농도를 낮추게 되면 정상적 일차발효 후에 이차발효가 진행됨으로써 결국 부패하게 된다. 장기간에 걸쳐 다양한 균의 복합적 작용으로 진행되는 저염 발효오이의 부패 과정을 이해하기 위하여 이에 관련된 균을 분리 동정하였다. 부패발효액을 무기배양하여 균을 분리하고 이들의 16s rRNA 유전자 부분을 universal primer를 이용한 PCR로서 증폭하여 서열분석 하였다. 분석된 800 염기 길이의 서열 전체를 그대로 이용하여 NCBI의 BLAST로서 유사종을 찾고 RDP의 Sequence Aligner와 Sequence Match에서 재확인하여 분리된 균을 3속 8종으로 동정하였다. Database 내의 표준균 서열을 기반으로 한 제한효소 지도와 동정된 균의 PCR 생성묵의 제한효소 처리결과(RFLP)를 비교하여 동정 결과를 실험으로 검정하였다. 동정과정에서 sequencing 결과 전체를 이용하는 점과 RDP를 통한 확인과 RFLP를 이용한 검정은 동정 결과에 대한 신뢰도를 한층 증가시켰다. 또 분리된 8종은 개별적 특징의 조사나 적절한 조합을 이룰 때의 상호 의존도 등을 조사할 수 있게 함으로써 여러 균에 의한 복합적 과정인 부패를 순차적 혹은 요인별로 나누어 살펴보는 연구를 가능하게 한다.

• 한국식품과학회지
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• 제32권6호
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• pp.1331-1335
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• 2000

김치 젖산균인 WL6는 API kit 또는 Biolog system방법에 의하여 동정한 결과, Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum 또는 Lactobacillus bifermentans로 나타나 동정되지 않았다. 그러나, pepN gene과 16S rRNA gene으로부터 2개의 specific-sequence primer set을 제조하여 PCR 방법으로 증폭한 후에 표준균주들과 비교한 결과, WL6는 Lactobacillus bifermentans로 추정되었다.

• 대한수의학회지
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• 제38권1호
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• pp.77-83
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• 1998

돼지 생식기호흡기증후군(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) 바이러스가 웅돈에 감염되었을 경우에는 정충의 기형 등 정액의 질 저하와 더불어 정액에 바이러스가 함유되어 있어 종부시 모돈에 바이러스를 전파하는 것으로 알려져 있다. 감염된 웅돈의 정액으로 인공수정을 실시할 경우 농장의 모돈 전체에 순식간에 바이러스를 전파하여 막대한 피해를 유발할 가능성이 높다. 따라서 감염웅돈을 신속히 검색하여 격리함으로써 피해를 사전에 방지해야 하며, 이를 위해서 웅돈의 감염여부를 신속히 확진하는 진단법의 개발이 필요한 실정이다. PRRS의 진단을 위해서는 바이러스학적인 진단법으로는 바이러스 분리동정, 혈청학적인 방법으로 바이러스 분리동정이 필수적이나 검사시간이 많이 소요되고, 분리동정 자체가 까다로운 단점이 있다. 본 연구에서는 웅돈의 정액내에서 PRRSV 바이러스에 대한 유전자를 RT-PCR법으로 증폭하는 방법을 개발하였으며, 진단의 민감도를 높이기 위하여 Nested PCR법으로 재확인 할 경우, 바이러스의 역가가 $1TCID_{50}$만 함유되어 있어도 진단이 가능한 조건을 확립하였다. 이 방법을 이용할 경우 웅돈의 정액시료에 대한 PRRS 바이러스 감염여부를 신속, 정확하게 검색하여 감염웅돈을 통한 PRRS바이러스의 전파를 미리 차단할 수 있으므로 PRRS방제에 효과적으로 이용될 것으로 사료된다.

• KSBB Journal
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• 제14권4호
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• pp.460-464
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• 1999

Methicillin-resistant Staphlococcus aureus(MRSA)는 다양한 항생제에 저항성을 나타내며 제 3세대 cephalosporin계가 보급된 1980년대 이후 원내 감염의 중요 원인균으로 대두되고있다. 그러나 MRSA 동정의 오류나 실수로 인한 부적절한 치료에 문제가 있으며 항생제의 오용으로 인한 다제약제 내성획득이 임상에서 심각한 문제가 되거 있다. 따라서 MRSA 감염의 적절한 치료는 이 원인 균의 신속하고 믿을 수 있는 동정을 필요로 한다.본 연구에서는 분자 생물학적인 동정법을 확립하기 위하여 항생제의 내성 기구인 페니실린 결합 단백질 2‘(PBP2')를 암호화하는 mec A 유전자를 PCR 방법으로 증폭하여 MIC test 결과와 비교하여 MRSA를 동정하는데 PCR법이 유용한지를 판명하였다.각 환자의 다종 검체로부터 S. aureus 120균주를 분리하여 oxcillin으로 MIC test를 한 결과 MRSA의 비율로는 농에서는 MRSA가 61.9%로 가장 높게 판명되었다. 120균주 중 MRSA 40균주, MSSA 40균주를 성별하여 PCR 방법으로 동정하여 MIC test와 비교 한 결과, MRSA 1균주(2.5%), MSSA는 2균주(5%)의 차이만이 MIC test와 상이성을 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때 PCR법으로 MRSA를 동정하는 것은 유용하며 일상검사 업무로서 활용성이 높을 것으로 판단되었다.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제16권4호
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• pp.251-257
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• 2001

Listeria monocytogenes와 L. ivanovii는 인간과 동물에 대한 식품 유래성 병원성 세균이다. Listeria 속에는 이들 병원균 외에 비병원성세균인 L. innocua, L, welshimeri, L. seeligeri, L.grayi 등 이 포함되어 있기에, 식품검사에서 배양법을 사용하는 종래의 Listeria의 검출방법은 시간과 많은 실험을 필요로 한다. 이런 이유 등으로 Literia의 종동정과 검출을 위한 신속한 검출법으로 Lis-mix multiplex PCR검출법 (Bubert et al., 1999)이 개발되었다. 본 연구에서는 식품검사에 활용하기 위한 실용적인 Lis-mix multiplex PCR 방법을 개발하고, 아울러 새로운 Siw-mixIII PCR 검출법을 개발하였다. 이 방법을 사용하여 식품에서 분리된 총 69개의 Listeria 균주를 성공적으로 종동정할 수 있었으며, Siw-mixIII multiplex PCR방법을 사용하여 L. ivanovii, L.welshimeri, L.seeligeri를 한번의 PCR로 검출 및 종동정을 할 수 있었다.

• 한국잠사곤충학회지
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• 제37권2호
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• pp.167-171
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• 1995

딱정벌레목 천공성 해충인 뽕나무 하늘소(Apriona germari)의 효과적인 방제를 위하여, 뽕나무 하늘소 이병충으로 부터 곤충병원 사상균을 분리하고, 위상차 현미경 및 주사전자현미경으로 관찰하였으며, PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 동정하였다. 뽕나무 하늘소 이병충으로 부터 분리된 곤충병원 사상균은 현미경 관찰 결과 Beauveria속의 전형적인 형태적 특성을 나타냈다. 따라서 이들의 용이한 동정을 위하여 PCR primer(5'-ACG GGC GCT C-3')를 이용한 RAPD(random amplification of polymorphic DNA) 방법으로 분석하고, B. bassiana와 B. brongniartii의 PCR 산물을 전기영동한 결과 DNA 표식자로 이용이 가능하였다. 이상의 결과로서 본 실험에서 분리·명명된 SFB-1A는 B. bassianifh, SFB-1A는 B. bassiana로, SFB-3A는 B. brongniartii로 동정되었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제38권4호
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• pp.455-460
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• 2010

16S rDNA 특이적 PCR과 증폭산물의 제한효소 처리 후, 나타나는 단편의 크기를 분석하는 PCR-RFLP 분석법을 김치에서 빈번하게 검출되는 Weissella 속 균주 10종의 신속하고 정확한 동정에 적용하였다. Weissella 속 균주 16S rDNA의 특이적 증폭에는 기존에 보고된 PCR primer를 사용하였지만, annealing 온도는 기존의 조건보다 $4^{\circ}C$ 높게 설정한 $65^{\circ}C$에서 PCR을 수행하였다. 증폭산물은 예상크기인 727bp와 일치하였으며, 제한효소 AluI, MseI, BceAI의 처리를 통하여 나타난 단편의 크기는 제한효소 절단위치 분석으로부터 추정한 단편의 크기와 일치하였다. W. kandleri, W. koreensis, W. confusa, W. minor, W. viridescens, W. cibaria, W. soli는 제한효소 AluI과 MseI의 사용으로 구분이 가능하였으며, W. hellenica, W. paramesenteroides의 경우, BceAI을 사용하면 독립적인 구분이 가능하였다. W. thailandensis의 경우, 본 실험에서 사용한 제한효소 AluI, MseI, BceAI에 의해 독립적인 band 양상은 나타나지 않았지만 나머지 9종과의 절단 양상 비교를 통해 구분이 되었으며, 제한효소 MspI을 사용하면 신속하게 동정할 수 있다.

• 미생물학회지
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• 제43권3호
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• pp.232-235
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• 2007

해양 및 토양에서의 암모니아 산화는 세균에 비해 Crenarchaeota 그룹의 archaea에 의해 우세하게 일어나고 있음이 알려졌다. 서해 갯벌에서, 배양에 의존하지 알고, 특정 암모니아 산화유전자(amoA)를 가진 archaea을 동정하고자 디지털 PCR법을 응용한 nested PCR법을 개발하였다. amoA와 16S rRNA유전자가 동시에 증폭된 샘플의 분석결과, 16S rRNA유전자에 비해 amoA 유전자의 다양성 이 높았으며, I.1a 그룹의 crenarchaea가 I.1b 그룹의 crenarchaea보다 갯벌지역에서 암모니아 산화에 우점적으로 기여하고 있음을 알 수 있었다. 본 연구에서 시도된, 디지털 PCR과 multiplex-nested PCR을 접목한 접근법을 이용하면 특정 기능유전자를 가진 미생물을 환경에서 검증하는데 응용할 수 있을 것이다.