• 한국양봉학회지
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• 제32권1호
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• pp.27-39
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• 2017

꿀벌 6종 주요 감염성 질병을 동시 진단하기 위한 PCR-chip 기반 초고속 다중 PCR 진단법을 개발 하였다. 6종 주요 꿀벌 감염성 병원체들은, 세균성 질병인 미국부저병의 원인균, Paenibacillus larvae와 유럽부저병의 원인균인 Melissococcus plutonius, 또한 진균인 Ascosphaera apis(백묵병), Aspergillus flavus(석고병)와 Nosema apis, Nosema ceranae(노제마병)를 선발하였다. 개발된 PCR-chip 기반 초고속 다중 PCR은, 꿀벌 주요 병원체 6종에 대하여 각기 $10^3$ 분자이상이 존재할 경우 모두 성공적 증폭을 보였으며, 증폭여부의 확인에 걸린 시간(Ct-time)은 6종 중 4종은 9분 내외, 2종은 7분 내외이었으며, 총 40회전의 PCR은 11분 42초, 융점분석 1분 15초로 총 PCR분석에 소요된 시간은 12분 57초(40회전 및 융점분석)이었다. 표준 DNA 기질을 사용한 PCR-chip 기반 초고속 다중 PCR은 100%에 근접한 정확도를 보였으며, 꿀벌 genomic DNA를 사용한 실험에서 false-amplification은 발견되지 아니하였다. PCR-chip 기반 초고속 다중 PCR은 실험실 내 초고속 진단 뿐 아니라 양봉 현장에서도 신속하고 효율적인 병원체 검출법이 될 것으로 기대한다.

• Journal of Microbiology
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• 제38권4호
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• pp.260-264
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• 2000

Reverse transcription (RT)-PCR and nested PCR methods (2-step PCR) were tested for their ability to detect marine birnavirus (MBV) in cultured rockfish, Sebastes schlegeli. One set of primers for RT-PCR was designed, based on a gene of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), and another set of primers for nested PCR was designed based on the VP2/NS junction region of MBV. This 2-step PCR method was specific for MBV and sensitivity was heightened when nested PCR was combined to RT-PCR. This 2-step PCR method was useful for detecting MBV not only in diseased fish, but also in asymptomatic fish. These results indicate that this 2-step PCR method is useful for detecting MBV in rockfish.

• 대한임상검사과학회지
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• 제46권2호
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• pp.47-53
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• 2014

The purpose of this study was to evaluate the clinical utility of TB/NTM PCR by comparing the results of TB PCR to detect Mycobacterium tuberculous (MTB) and nontuberculous mycobacteria (NTM) from paraffin-embedded tissue specimens. A total of 60 cases were tested using TB PCR and TB/NTM PCR. The MTB and NTM rate of TB/NTM PCR was 84.2% (16/19), 10.5% (2/19) in TB positive of TB PCR. The NTM rate of TB/NTM PCR was 29.3% (12/41) in TB negative of TB PCR. Fourteen different species of NTM were identified, the common isolate was M. gordonae (21.4%), M. avium (14.3%), M. ulcerans (7.1%), M. interjectum (7.1%), M. gilvum (7.1%), M. fortuitum (7.1%), M. mucogenicum (7.1%). The rare species identified were M. farcinogenes (7.1%), M. tokaiense (7.1%). Therefore, TB/NTM PCR is useful to differentiate MTB and NTM from paraffin-embedded tissue specimens and it is more effective in detecting NTM with TB PCR.

• 미생물학회지
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• 제43권2호
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• pp.91-99
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• 2007

인간면역결핍바이러스(Human immunodeficiency virus; HIV) 진단을 위한 다중, 초고속실시간 PCR법을 개발하였다. 검출대상의 DNA 염기서열은 env 유전자를 기반으로 설계되었으며, 각기 HIV-1 특이 495염기(gi_1184090) 및 HIV-2 특이 294염기(gi_1332355)의 DNA를 안정상의 이유로 PCR을 이용한 유전자합성법으로 제작하여 사용하였다. 초고속 실시간 PCR은, PCR의 회전 중 각 단계별 설정시간을 극단적으로 축소하여, $1\;{\mu}l$의 PCR 용액용 microchip을 탑재할 수 있는 $Genspector^{TM}$을 사용하여 수행하였다. DNA 증폭과 융점분석을 포함한 총 PCR 검색 시간은 HIV_1 및 HIV-2 모두에서 15분 이내로 완료되었으며, 각기 최소 2.3개의 합성 env 유전자로부터도 HIV-1 특이 117염기와 HIV-2 특이 119염기의 PCR산물을 성공적으로 증폭시킬 수 있는 민감성을 보여주었다. 이런 형식의 실시간 PCR법을 본 연구에서 초고속실시간 PCR (Ultra-rapid real-time PCR)이라 명명하였다. 이는 본 연구의 대상인 HIV에 대한 보조적 진단방법일 뿐 아니라 PCR 검색법이 사용되고 있는 다른 병원체에 대하여도 적용될 수 있을 것이나, 우선 HIV 임상시료에 대한 본 검색법의 효용성 실험 등 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.

• 한국치위생학회지
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• 제17권2호
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• pp.319-330
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• 2017

Objectives: The purpose of this study was to compare SYBR Green qPCR, TaqMan, and bacterial selective medium cultures for accurate quantitative analysis of oral microorganisms. Methods: The SYBR Green method is widely used to analyze the total amount of oral microorganisms in oral saliva. However, in this study, MTR-PCR method based on TaqMan method was performed using newly developed primers and probes. In addition, it was designed to confirm the detection agreement of bacteria among bacteria detection method. Results: As a result of MRT-PCR and SYBR Green qPCR analysis, more than 40 times (0.9-362.9 times) bacterium was detected by MRT-PCR. In addition, more bacteria were detected in saliva in the order of MRT-PCR, SYBR Green qPCR, and bacterium culture, and the results of MRB-PCR and SYBR Green qPCR showed the highest agreement. The agreement between the three methods for detecting P. intermedia was similar between 71.4 and 88.6%, but the agreement between MRT-PCR and SYBR Green qPCR was 80% for S. mutans. Among them, the number of total bacteria, P. intermedia and S. mutans bacteria in saliva was higher than that of SYBR Green qPCR method, and bacterium culture method by MRT-PCR method. P. intermedia and S. mutans in saliva were detected by MRT-PCR and MRT-PCR in 88.6% of cases, followed by the SYBR Green qPCR method (80.0%). Conclusions: The SYBR Green qPCR method is the same molecular biology method, but it can not analyze the germs at the same time. Bacterial culturing takes a lot of time if there is no selective culture medium. Therefore, the MRT-PCR method using newly developed primers and probes is considered to be the best method.

• 한국식품영양과학회지
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• 제29권6호
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• pp.1016-1024
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• 2000

본 연구는 식품에 존재하는 L. monocytogenes균의 신속한 검출방법을 조사하기 위하여 hlyA 유전자 primer 를 사용하여 PCR 기법으로 행하였으며 primer의 특이성과 PCR의 민감성, L. monocytogenes균의 검출을 위한 최적조건 및 우유 및 소고기의 적용시험을 각각 조사하였다 PCR 특이성 실험에서는 L. monocytogenes 20주에 대한 PCR 분석 결과 모두 713 bp 크기의 PCR products를 확인할 수 있었고, Listeria spp. 및 다른 세균에서는 동일한 Poducts가 증폭되지 않으므로써 hiyA based primer의 L. monocytogenes에 대한 PCR 특이성이 관찰되었다. PCR 분석법의 민감도는 L. monocytogenes ATCC 19111의 1 pg DNA와 2.4$\times$$10^4$cell 수준에서 target DNA가 증폭되었다. Tailing의 제거와 민감도를 높이기 위하여 PCR cycle 수에 따른 최적조건을 조사한 결과 20~30 cycle 정도의 PCR clcyle 수가 좋은 것으로 나타났으며 민감도는 20 cycle PCR amplification을 행한 후 한번 더 10~15 cycle로 처리했을 때 훨씬 증가하였다. 한편, 우유(10 mL)와 쇠고기 절편(10g)에 0~$10^{7}$ CFU/mL 또는 g 수준으로 L. monocytogenes를 신속하게 검출하기 위하여 PCR을 적용한 결과, 우유시료에서는 2번 PCR을 반복함으로써 2 cells까지 검출할 수 있었고, 쇠고기 절편은 LEB로 35$^{\circ}C$에서 24시간 증균하여 PCR합으로써 2.6$\times$$10^2$cell가지 검출할 수 있었다.

• 식물병연구
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• 제21권2호
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• pp.74-81
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• 2015

박과 작물에서 과일썩음병(bacterial fruit blotch)을 일으키는 Acidovorax citrulli를 종자로부터 검출하기 위한 특이적이고 민감한 nested-PCR 방법을 개발하였다. 본 연구에서는 Next Generation Sequencing을 이용하여 draft genome sequencing을 얻은 후 이를 분석하여 PCR 프라이머를 디자인하였고, 이들 프라이머의 A. citrulli에 대한 특이성을 확인하여 Ac-ORF 21F/Ac-ORF 21R의 nested PCR 프라이머를 최종 선발하였다. Ac-ORF 21F/Ac-ORF 21R는 오직 A. citrulli에서만 특이적으로 140bp 크기의 DNA를 증폭하였으며, 그 검출민감도는 1차 PCR 검출한계(10 ng genomic DNA/PCR)보다 검출한계를 10,000배 증가시켰다. 개발된 nested-PCR 방법을 통해 병원균을 인공접종한 수박 종자의 외부검사에서 $10^1cfu/ml$까지 인공 접종 한 모든 종자 시료에서 병원균을 검출하였고, 병원균을 인공접종 한 수박 종자의 내부검사에서는 병원균이 검출되지 않았다. 자연 감염 수박 종자의 외부검사에서는 10개의 반복 시료 중 2개에서, 그리고 종자 내부검사에서는 10개의 반복 시료 중 5개에서 A. citrulli를 검출하였다. 본 연구에서 개발한 nested-PCR은 특이성과 민감도가 높고 인공접종과 자연감염 수박 종자에서도 병원균의 검출이 가능하여 박과 작물의 종자로부터 A. citrulli를 검출하는데 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

• 식물병연구
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• 제27권3호
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• pp.120-127
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• 2021

식물 바이러스는 작물 수확량에 상당한 손실을 일으키고 작물 생산을 지속적으로 위협하여 세계 식량 안보에 심각한 위협이 된다. 그 중 tomato spotted wilt virus (TSWV)는 주로 원예작물을 감염시키는 가장 위협적인 식물 바이러스로 넓은 기주 범위를 가진다. Reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR)은 TSWV의 민감한 검출을 위해 널리 사용되고 있지만 표준화의 어려움으로 인해 유용성이 감소한다. 따라서 본 연구에서는 TSWV 검출을 위해 민감하고 정확한 reverse transcription droplet digital polymerase chain reaction (RT-ddPCR)을 확립하였다. TSWV 검출에 대한 RT-qPCR 및 RT-ddPCR의 민감도를 비교하였고, TSWV에 대한 RT-ddPCR의 특이성 분석은 고추에서 주로 발생하는 바이러스 및 음성 대조군에서 특이성을 확인한 결과 증폭되지 않았다. RT-ddPCR 및 RTqPCR에 의해 측정된 TSWV의 선형회귀곡선은 모두 높은 선형성을 나타냈지만, RT-ddPCR 분석이 10배 이상 더 민감하고 더 낮은 TSWV의 copy 수를 검출할 수 있었다. 종합적으로, 우리의 연구 결과는 RT-ddPCR이 TSWV 검출에 대해 높은 민감도와 특이성을 제공하고 낮은 농도의 현장 시료에서 TSWV 검출하는 데 적합하다는 것을 보여준다.

• 한국양식학회지
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• 제10권2호
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• pp.171-178
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• 1997

Infectious pancreatic necrosis virus (IPNV)는 치어에 감염되어 치명적인 질병을 유발하는, 양식산업에 있어 중요한 어류 병원체이다. 본 연구에서는 IPNV를 신속, 정확하게 진단하는 방법을 개발하고자 IPNV의 항원성 단백질인 VP2 유전자 부분에서 선택한 primers를 이용하여 역전사-중합효소연쇄반응법(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 실시하였다. RT-PCR 증폭법으로 순수분리도니 IPNV dsRNA 40 ng 정도의 적은 양도 확인 할 수 있었으며, IHNV와 같은 다른 어류 병원체의 게놈을 RT-PCR templates로 사용하였을 경우는 어떠한 PCR 산물도 검출되지 않는 특이성을 보였다. 특히 유전자의 분리없이 조직 그 자체를 대상으로 RT-PCR을 행하는 in situ RT-PCR 방법으로 IPNV가 감염된 넙치 (Paralichthy olivaceus) 치어의 조직에서 IPNV 감염을 신속하게 확인할 수 있었다. 따라서 RT-PCR 및 in situ RT-PCR 방법은 IPNV를 신속, 정확하게 진단하는데 활용될 수 있을 것으로 생각된다.

• Clinical and Experimental Pediatrics
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• 제49권7호
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• pp.745-750
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• 2006

목 적 : 장바이러스는 모든 연령층에서 무균성 뇌막염의 가장 흔한 원인으로 확진은 뇌척수액에서 직접 바이러스를 검출하는 것이나 시일이 많이 걸리고 민감도가 낮아 뇌척수액, 대변 등 환자의 검체에서 바이러스 RNA를 탐지하는 PCR법이 대두되었다. 무균성 뇌막염 환자에서 뇌척수액과 대변의 채취 시기에 따라 검체별 PCR 양성률이 달라서 이에 관한 평가가 필요하다. 이에 저자들은 소아 환자에서 무균성 뇌막염을 진단함에 있어 증상 발현 후 뇌척수액과 대변 검체의 채취 시기에 따른 검체별 PCR의 유용성을 알고자하였다. 방 법 : 2005년 6월 11일부터 8월 30일까지 부산 일신기독병원에 입원하여 무균성 뇌막염으로 진단 받은 42례를 대상으로 임상 증상의 발현 시점에서 뇌척수액과 대변 채취 시기에 따른 검체별 PCR 결과를 조사하였다. 결 과 : 뇌척수액의 경우 증상 발현 시점부터 검체 채취 시기까지의 기간이 2일 이내였던 18례 중 PCR 양성은 9례(50.0%)로 2일이 지나 채취된 검체 24례 중 PCR 양성 1례(4.2%)에 비해 유의하게 높았다(P=0.001). 반면 대변의 경우는 일주일까지 채취 시점에 관계없이 PCR 양성률이 평균 90.5%로 지속적으로 높았다. 뇌척수액 10례(23.8%)에서 장바이러스 PCR이 양성이었고, 바이러스가 밝혀진 9례(21.4%)에서 coxsackievirus B5 6례, coxsackievirus B3 3례였다. 대변의 경우 42례 중 38례(90.5%)에서 장바이러스 PCR이 양성으로 echovirus 18 7례, echovirus 9 3례, coxsackievirus B5 8례, coxsackievirus B3 3례였다. 뇌척수액과 대변에서 동시에 배양된 경우는 6례로 모두 coxsackievirus B5였다. 결 론 : 대변을 이용한 PCR은 장바이러스 뇌막염 동안 장바이러스를 검출하는 임상적으로 민감한 검사법으로 질병 경과 동안 진단을 예측하게 한다. 결정적인 진단은 뇌척수액 PCR에 의해 얻어지나 발병 2일 후 얻어진 검체에서는 그 유용성이 매우 낮아서 임상 증상이 2일 이상 경과하였을 때는 뇌척수액 PCR 이외에 대변을 이용한 PCR을 같이 검사하는 것이 도움이 된다.