• The Korean Journal of Physiology
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• 제25권2호
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• pp.179-188
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• 1991

Effect of a sulfhydryl reagent, p-chloromercuribenzoic acid (PCMB), on the transport of succinate was studied in brush border (BBMV) and basolateral (BLMV) membrane vesicles isolated from rabbit renal cortex. PCMB induced an irreversible inhibition of the $Na^+-dependent$ succinate uptake in a dose-dependent manner with $IC_{50}$ of 55 and $65\;{\mu}M$ in BBMV and BLMV, respectively. The inhibitory effect of PCMB was prevented by a pretreatment of vesicles with dithiothreitol. PCMB did not increase $Na^+$ permeability at concentrations inhibiting succinate uptake. The PCMB inhibition of succinate uptake was due to a change in Vmax, but not in Km. When membrane vesicles were pretreated with PCMB in the presence of unlabelled succinate, the inhibitory effect was significantly reduced. In both BBMV and BLMV, succinate uptake was inhibited by various sulfhydryl reagents with the inhibitory potency of following order: $HgCl_2$>DTNB>PCMBS>PCMB. These results suggest that sulfhydryl groups are essential for dicarboxylate transport and that they may be located at or near substrate binding sites of the transporters in renal brush border and basolateral membranes.

• The Korean Journal of Physiology
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• 제24권2호
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• pp.345-352
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• 1990

To determine the role of sulfhydryl group in transport of organic ions across the basolateral membrane of renal proximal tubules, effect of p-chloromercuribenzoic acid (PCMB) on the transport of tetraethylammonium (TEA) and p-aminohippurate (PAH) was studied in rabbit renal cortical slices. PCMB caused irreversible inhibition of TEA and PAH uptake in a dose-dependent manner, with $I_{50}$ value (concentration for 50% inhibition) of $30\;{\mu}M$ for TEA and $75\;{\mu}M$ for PAH. Kinetic analysis of TEA and PAH uptakes showed that PCMB decreased Vmax $(62.35\;vs.\;28.32\;n\;mole/g{\cdot}min\;fur\;TEA:\;385.24\;vs.\;170.36\;n\;mole/g{\cdot}min\;for\;PAH)$ without changing Km. The inhibitory action of PCMB on TEA and PAH uptakes was independent of pH of the pretreatment medium. The inhibitory effect of PCMB on the uptake of TEA or PAH was prevented by dithiothreitol, but not by the substrate. PCMB inhibited Na-K-ATPase activity in a dose-dependent manner with $I_{50}$ value of $50\;{\mu}M$, which is similar to those for TEA and PAH uptake. These results suggest that PCMB inhibits the transport of organic cations and anions in the renal basolateral membrane by directly affecting the SH-group in the transporter molecules or secondly by altering the Na-K-ATPase activity.

• 미생물학회지
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• 제32권3호
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• pp.222-231
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• 1994

Saccharomyces cerevisiae에서 얻은 purine nucleoside phosphorylase (PNP)의 반응 기작을 밝히기 위해 반응속도론적 분석이 수행되어졌다. 반응기작에 PNP${\cdot}$phosphate와 PNP${\cdot}$ribose 1-phosphate의 binary complex가 형성되는 것으로 추정되어진다. Initial velocity와 product inhibition study의 결과는 반응이 ordered bi, bi reaction으로 일어난다는 것과 일치하고 있다. 두 개의 기질중 무기인산이 효소에 먼저 붙고, 그 다음에 nucleoside, 그리고 base가 효소를 떠나는 첫 번째 생성물이고 마지막으로 ribose 1-phosphate가 생성되고 효소는 원래의 상태로 돌아간다. 반응속도론적 분석에 이해 제안된 작용기작은 sulfhydryl reagents인 p-chloromercuribenzoate(PCMB) and 5,5'-dithiobisnitrobenzoate (DTNB)에 의한 효소의 불활성화에 대한 기질으 보호작용의 결과와 일치하고 있다. PNP는 ribose 1-phosphate와 phosphate에 의해 보호되지만 nucleoside나 base에 의해서는 아무런 효과과 없다는 사실은 반응 순서가 효소에 무기인산이 먼저 붙는 ordered bi, bi 기작이라는 것을 지지하고 있다. PCMB 나 DTNB에 의해 불활성화된 PNP는 dithiothreitol(DTT)에 의해서는 활성이 완전히 회복되고 2-mercaptoethanol에 의해서는 77%의 활성이 회복된다는 사실은 효소의 불활성화가 가역적이라는 것을 시사하고 있다. PCMB에 의해 불활성화된 효소는 inosine이 변화하는 기질일때 정상효소보다 높은 $K_m$과 낮은 $V_m$ 값을 보여주고 이런 현상은 DTT 처리시 원래의 상태로 돌아온다. DTNB에 의해 불활성화된 효소는 PCMB 처리시와 비슷하게 정상효소보다 높은 $V_m$ 값을 보이지만 $V_m$ 값은 큰 변화가 없다. S. cerevisiae PNP에서 발견되는 높은 무기인산의 농도에서의 하위단위체간의 음성적 협동성이 PCMB나 DTNB를 처리한 PNP에서는 보이지 않았다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제40권4호
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• pp.277-282
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• 1997

아라비돕시스 탈리아나의 아세토락테이트 합성 효소 (ALS)를 그 유전자를 포함하고 있는 대장균 MF 2000/pTATX로부터 부분 정제하였다. 부분 정제된 이 효소를 가지고 여러 가지 변형 화학물질들 즉, 요오드아세트산, 요오드아세타마이드, N-에틸말레이미드 (NEM), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), 파라염화수은벤조산 (PCMB), 그리고 페닐글리옥살 등에 대한 민감성을 조사하였다. PCMB가 가장 민감하게 저해를 했으며, DTNB와 NEM이 그 뒤를 따랐다. 이 효소의 기질인 피루브산이 요오드아세트산에 의한 활성 저해를 보호하지 못하였으므로 기질의 결합에 시스테인의 관련이 없는 것 같이 보인다. 한편, 기질이 페닐글리옥살에 의한 효소의 활성 저해를 부분적으로 보호하는 것으로 보아 기질이 아르기닌기와 상호 작용함을 암시하고 있다. 부분 정제된 효소는 발린과 이소루신에 민감하게 방해를 받았으나 루신은 그렇지 않았다. 그러나, PCMB로 변형시킨 효소는 되먹임 방해를 더 강하게 받았다. 그 외 ALS에 대한 새로운 제초제 후보인 피리미디설퍼 벤조산 유도체의 저해 효과를 검토하였다.

• 대한화학회지
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• 제50권5호
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• pp.362-368
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• 2006

포스포리파아제 D(PLD)의 8개의 시스테인 잔기들의 특성을 파악하기 위해 설프히드릴(SH)기와 반응하는 각종 화학물질들을 동원하였다. 5,5-다이티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB)는 시스테인 잔기의 SH기를 적정하기 위해 이용하였으며, 412nm에서의 환원된 DTNB의 값으로부터 자연 상태의 PLD는 1몰 당 4개의 SH기가 있는 것으로 나타났으나, 8 M의 요소 등으로 3차원 구조를 교란 시킨 변성된 PLD는 8개의 SH기가 적정되었다. 이 결과로 시스테인 잔기의 반(4개)은 외부에 노출되어 있고 그 나머지 반은 내부에 가려져 있다고 추정할 수 있다. SH기 변형 시약인 p-클로로머큐리벤조산(PCMB), 요오드아세트산, 요오드아세트아미드, 그리고 N-에칠마레이미드 등은 모두 PLD를 비활성화 시켰다. 이들 중 다이티오스라이톨(DTT)로 처리했을 때 유일하게 PCMB에 의해 비활성화 된 PLD는 가역적으로 그 활성이 회복되었다. 다양한 작용기를 갖는 다이설파이드들을 이용한 노출된 SH기의 주위 환경을 검토한 결과 음전하나 전하를 띄지 않은 다이설파이드들이 양전하를 띈 시스타민 보다 더 효과적으로 PLD를 비활성화 시키는 것으로 나타났다. 그 이외 시스테인 잔기의 산화-환원 전환이 PLD 활성에 미치는 영향을 과산화수소를 이용하여 검토하였다. 과산화수소 산화에 의해 70% 이상 잃은 PLD 활성은 대부분 DTT에 의해 복원되었다. 이들 결과로부터 양배추 PLD의 시스테인 잔기들이 모두 SH기로 존재한다는 것을 반응을 통해 확인 할 수 있었으며, 또한 외부에 노출된 4개의SH기는 PLD 활성 조절에 지대한 영향을 미치고 있는 것으로 나타났다.

• BMB Reports
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• 제28권1호
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• pp.40-45
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• 1995

Acetolactate synthase purified from Serratia marcescens ATCC 25419 was rapidly inactivated by the thiol specific reagent p-chloromercuribenzoate (PCMB), the tryptophan specific reagent N-bromosuccinimide (NBS), and the arginine modifying reagent phenylglyoxal (PGO). Inactivation by PCMB was prevented by both ${\alpha}$-ketobutyrate and pyruvate, and the second order rate constant for the inactivation was $2480\;M^{-1}{\cdot}min^{-1}$. The reaction order with respect to PCMB was 0.94. The inactivation of the enzyme by NBS was also substantially reduced by both ${\alpha}$-ketobutyrate and pyruvate. The second order rate constant for inactivation by NBS was $15,000\;M^{-1}{\cdot}min^{-1}$, and the reaction order was 2.0. On the other hand, inactivation by PGO was partially prevented by ${\alpha}$-ketobutyrate, but not by pyruvate. The second order rate constant for the inactivation was $1480\;M^{-1}{\cdot}min^{-1}$ and the order of reaction with respect to PGO was 0.75. These results suggest that essential cysteine, tryptophan and arginine are located at or near the substrate binding site.

• 미생물학회지
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• 제32권1호
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• pp.84-90
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• 1994

Adenosine deaminase (ADA)의 여러 기질과 억제물질의 반응 속도론적 상수가 Aspergillusoryzae의 세포내 효소인 ADA의 활성자리에 어떻게 부착하고 어떤 요인을 필요로 하는지를 알기위해 측적되어졌다. kcat/$K_m$값에 의하면 조사된 기질로 작용하는 화합물 중에 3'-deoxyadenosine이 가장 좋은 기질로 작용하는 것으로 밝혀졌다. 몇 개의 유사체가 억제물질로 조사되었는데 purine riboside가 $3.7{\times}10^{-5}$M의 값 $K_i$값을 가지고 가장 강한 억베물질로 나타났다. Adenine은 기질로도 억제물질로도 작용을 못하므로 adenine의 N-9 위치의 ribose가 효소에 부착하는데 중요하다는 것을 시사하고 있다. 또 ADA는 6-chloropurine riboside(6-CPR)의 dechlorination을 촉매화하여 inosine과 Cl이온을 생성한다. 6-CPR의 ADA에 대한 기질 특이성은 정상 기질인 adenine의 0.86%로 측정되었다. ADA의 경쟁적 억제물질인 purine riboside는 비슷한 $K_i$값을 가지고 dechlorination도 억제하므로 deamination과 dechlorination 반응은 효소의 부착자리를 공유하고 있다고 생각되어진다. SH기에 작용하는 화합물중 수은제인 p-chloromercuribenzoate(PCMB), mersalyl acid, $HgCl_2$는 효소의 deamination 반응을 억제했다. Mersalyl acid에 의해 활성이 억제된 ADA는 thiol reagent인 dithiothreitol이나 2-mercaptoethanol에 의해 활성이 회복되지만 PCMB에 의해 억제된 효소는 회복되지 않았다. 각 수은제들이 억제물질로 작용할 때 $K_i$값과 억제양상이 측정되었는데 모두 경쟁적 방해를 보였다. $K_i$값은 10mM 인산완충용액에서 측정한 것이 100 mM 인산완충용액에서 측정한 것보다 훨씬 낮아 인산기가 기질이 아니어도 효소의 부착에 큰 영향을 미치는 것을 보여주고 있다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제25권2호
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• pp.109-114
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• 1997

The Oomycete Saprolegnia ferax produces an extracellular $\beta$-amylase, Maximum enzyme yield was attained after 7 days of growth in YNB starch medium (pH 6.5) at 25$\circ$C. The amylase was pu- rified 24-fold by ultrafitration, HPLC DEAE column and HPLC gel filtration. The purfied enzyme was a monomeric glycoprotein with a molecular weight of about 44,000 dalton. The pH and temperature optima were 6.5 and 50$\circ$C, respectively. The enzyme was fairly stable up to 50$\circ$C and at acidic pH region (pH 4.0-7.0). The apparent Km and Vmax values of the enzyme against soluble starch were 0.77 mg/ml and 2,174 $\mu$moles/mg protein, respectively. Amino acid analysis indicated that the enzyme was enriched in alanine, glycine, leucine and acidic amino acid. Starch hydrolysis with the enzyme released maltose but not glucose, whereas maltotriose, Schardinger dextrin ($\alpha$-cyclodextrin) and pullulan were not hydrolysed by the enzyme. The enzyme was inhibited by Schardinger dextrin, p-chloromercuribenzoate(PCMB), CU$^{2+}$' and Hg$^{2+}$. Inhibition of the enzyme by PCMB could be reversed by the addition of cysteine and mercaptoethanol.

• 대한화학회지
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• 제40권1호
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• pp.72-80
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• 1996

Chitinase를 생성하는 세균인 serratia marcescens JM을 해안 갯벌 시료로부터 분리하여, ammonium sulfate precipitation, affinity adsorption, hydroxylapatite와 Sephadex G-200 column chromatography를 통하여 정제하였다. 정제된 chitinase는 7.1% 회수율과 4.22의 정제도를 나타내었으며, 전기영동시 단일밴드를 얻을 수 있었고, SDS-PAGE에 의해 측정된 분량은 59,000으로 나타났다. 정제된 chitinase의 $K_m$과 $V_{max}$는 5.71mg/mL과 39.8 unit/mL로 나타났다. Chitinase의 최적활성 pH와 온도는 7과 50$^{\circ}C$였고 최적안정pH는 7.0이며 50$^{\circ}C$이하에서는 안정하였다. $Cu^{2+}\;Ca^{2+}$ 및 $Mg^{2+}$는 효소활성을 증가시켰으나 $Hg^{2+}$와 $I_2$는 효소 활성을 억제시켰다. 또한 cysteine은 효소활성을 증가시키나 EDTA, MIA, PCMB, 및 SDS는 효소활성을 억제시켰다. 해수 음이온 중 $MG^{2+},\;Ca^{2+},\;K^+$는 효소활성을 약간 증가시켰으나 $Na^{2+}$ 이온은 1mM이상농도에서 활성이 억제되었다. 본 논문에서 정제된 chitinase는 여러가지 특이점이 있는 serratia효소였다.

• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제48권2호
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• pp.75-78
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• 2005

Halotolerant protease produced by Halomonas marisflava KCCM 10457 was partially purified through ammonium sulfate precipitation and Sephacryl S-200HR gel permeation chromatography. Optimal pH and temperature of protease were 11.0 and $45^{\circ}C$, respectively. Enzyme activity was inhibited by $Cu^{2+}$, $Hg^{2+}$, $Fe^{2+}$, and $Fe^{3+}$, and selectively inhibited by p-chloromercuribenzoic acid (PCMB), suggesting this enzyme is cysteine protease. The enzyme is halotolerant, because it retained 77% of original activity in presence of 3.33 M NaCl. The protease showed broad substrate specificity to various natural proteins; BSA, casein, egg albumin, gelatin, and hemoglobin.