• 생명과학회지
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• 제13권6호
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• pp.879-888
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• 2003

추에서 항균 phytoalexin으로 알려진 capsidiol의 생합성을 촉매하는 5-epi-aristolochene hydroxylase는 cytochrome P450 (P450) 억제제인 ancymidol과 ketocornazol에 의해 그 활성이 특이적으로 억제되어, 이 효소가 P450계 효소임을 알 수 있었다. P450 효소가 공통으로 보유하는 염기서열을 지닌 primer를 이용하여 RT-PCR과 cDNA screening을 실시한 결과 고추배양세포에서 elicitor 처리에 의해 강하게 유도되는 cDNA (P450Hy01)를 cloning하였다. 배양세포에 cellulase, arachidonic acid, jasmonic acid, 자외선 등을 처리하여 capsidiol을 생합성하는 량과 P450Hy01 mRNA의 발현정도는 밀접한 유사성이 있었다. P450Hy01의 염기서열은 담배에서 밝혀진 5-epi-aristolochene-1,3-hydroxylase와 98%의 유사성이 있었으며, P450 효소가 공통으로 지니는 heme-binding domain인 FxxGxRxCxG를 보유하고 있었다 이러한 결과는 본 연구에서 cloning된 P450Hy01이 고추의 세포에서 capsidiol의 생합성을 촉매하는 5-epi-aristolochene hydroxylase 효소를 coding 하고 있음을 시사한다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제30권1호
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• pp.1-7
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• 2002

토양으로부터 phytate 분해능이 뛰어난 phytate를 생산하는 균주를 분리 동정한 결과 Escherichia coli로 동정되었고, E. coli WC7으로 명명하였다. 이 균주가 생산하는 phytase를 ammonium sulfate 침전, Phenyl-Sepharose, DEAE-Sepharose, CM-Sepharose, Resoure S, Mono S 컬럼 크로마토그래피를 이용한 분리정제를 수행하여 정제도 1,250 배, 수율 30%로 정제하였고 640 Unit/mg의 비활성을 얻었다. 또한 정제된 phytase는 SDS-PAGE에서 분자량 45kDa인 단일 subunit로 이루어진 단일효소임을 확인하였다. E. coli WC7 phytase의 최적 pH는 5.0, 최적 온도는 $60^{\circ}C$였으며, pH 2.0-12까지 안정하였다. 열안정성에서는 $60^{\circ}C$이상에서 급격한 활성의 감소를 보여 초기 활성의 20% 활성만을 나타내었다. Phytase의 N-말단 아미노산 서열은 Ser-Glu-Pro-Clu-Leu-Lys-Leu-Glu-Ser-Val-Val이었으며 이는 E. coli 유래의 pH 2.5 acid phosphatase와 아주 큰 유사성을 보였다. S. coli WC7 phytase의 유전자를 확보하기 위해 E. coli acid phosphatase의 DNA sequence를 바탕으로 한 primer들을 이용하여 PCR 클로닝을 수행하였으며 증폭된 PCR fragment를 pUC19 벡터에 클로닝 하고 DNA 염기서열을 결정하였다. 그 결과 1.2 kbp의 WC7 phytase 유전자의 ORF를 확인하였으며 432개의 아미노산으로 이루어진 분자량 44,716 Da의 단백질을 확인 할 수 있었다. 대부분의 acid phosphatase 효소들의 active site라고 추정되는 active site motif인 RHGXRXP가 N-terminal 쪽에 존재하고 있었다. pUEP를 이용하여 E. coli XL1-Blue에서 phytase를 발현시켰을 때 효소의 생산량이 17.5 U/ml로서 원균주의 23배 활성을 가졌으며,효소의 비활성 및 pH 안정성 측면에서 높은 산업적 이용가능성을 볼 때 사료첨가제 효소로의 개발을 기대할 수 있을 것이라 판단된다.

• 한국패류학회지
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• 제30권4호
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• pp.399-408
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• 2014

본 연구에서는 북방전복 (Haliotis discus hannai)의 대용량 염기서열 분석을 통해 GST유전자의 전장 cDNA를 동정하였다. 북방전복 GST 유전자의 총 길이는 1669 bp로 672 bp의 ORF는 총 223개의 아미노산을 코딩하고 있으며 등전점은 5.69, 분자량은 25.8 kDa으로 예측되었다. 북방전복 GST아미노산 서열은 둥근전복과 지중해 담치와 같은 패류의 GSTA와 가장 유사성이 높았으며 계통수 분석을 통해 GSTA와 하나의 그룹을 이루었다. 북방전복 GST에는 GSTA의 특징을 갖는 두 site (N-말단의 G-site, C-말단의 H-site)가 보존되어 있었고 효소활성과 구조 유지에 중요한 잔기가 종간에 매우 보존되어 있었다. 북방전복 GST 유전자의 mRNA는 관찰된 모든 조직에서 발현하고 있었으며, 특히 외투막, 아가미, 간췌장, 소화관에서 높은 발현이 확인되었다. 북방전복의 GST는 비브리오균을 인위감염 시킨 전복의 간췌장에서 감염 후 1시간 뒤 발현이 급격히 증가했다가 3시간까지 증가한 뒤 감소하였고, 혈구세포에서는 감염 3시간 경과 후 발현 정도가 최고로 증가했다가 감소하였다. 따라서 북방전복 GST는 alpha class GST의 특징을 가지며 병원체 감염에 따른 면역반응 조절에 관여할 것이라 생각되며 병원균 감염에 따른 바이오마커로 활용가능 할 것이라 예상된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제14권6호
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• pp.1239-1248
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• 2004

The methylotrophic yeast Hansenula polymorpha has been extensively studied as a model organism for methanol metabolism and peroxisome biogenesis. Recently, this yeast has also attracted attention as a promising host organism for recombinant protein production. Here, we describe the fabrication and evaluation of a DNA chip spotted with 382 open reading frames (ORFs) of H. polymorpha. Each ORF was PCR-amplified using gene-specific primer sets, of which the forward primers had 5'-aminolink. The PCR products were printed in duplicate onto the aldehyde-coated slide glasses to link only the coding strands to the surface of the slide via covalent coupling between amine and aldehyde groups. With the partial genome DNA chip, we compared efficiency of direct and indirect cDNA target labeling methods, and found that the indirect method, using fluorescent-labeled dendrimers, generated a higher hybridization signal-to-noise ratio than the direct method, using cDNA targets labeled by incorporation of fluorescence-labeled nucIeotides during reverse transcription. In addition, to assess the quality of this DNA chip, we analyzed the expression profiles of H. polymorpha cells grown on different carbon sources, such as glucose and methanol, and also those of cells treated with the superoxide­generating drug, menadione. The profiles obtained showed a high-level induction of a set of ORFs involved in methanol metabolism and oxidative stress response in the presence of methanol and menadione, respectively. The results demonstrate the sensitivity and reliability of our arrays to analyze global gene expression changes of H. polymorpha under defined environmental conditions.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제44권3호
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• pp.317-323
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• 2016

본 연구에서는 C. fermentati SI가 생산하는 isoflavone 배당체 가수분해 효소를 클로닝하여 염기 서열을 밝힌 뒤 P. pastoris X-33에 형질전환하여 재조합 효소의 과발현을 시켰고, 또한 재조합 isoflavone 가수분해 효소의 효소학적 특성을 조사하였다. 재조합 isoflavone 가수분해 효소의 분자량은 약 50.4 kDa이었으며, Meyerozyma guilliermondii ATCC 6260의 exo-1,3-β-glucanase와 96%로 가장 높은 homology를 나타내었다. exo-1,3-β-glucanase의 ORF는 pPICZA 벡터로 클로닝 후 P. pastoris X-33으로 형질전환을 하였으며, His6-tag을 이용하여 효소를 정제하였다. 정제된 효소는 citrate phosphate buffer pH 4.5에서 최적 활성을 나타내었으며, 효소의 최적 활성 온도는 40℃로 나타났다. 40℃이상에서는 효소의 활성이 급격하게 감소함을 확인 하였으며, pH 안정성을 조사한 결과 비교적 넓은 범위인 4−8 사이에서 80%이상의 활성을 유지하였다. 따라서, 재조합 효소의 과발현을 통해 isoflavone aglycone의 효율적인 생산에 이용할 수 있을 것으로 사료된다.

• BMB Reports
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• 제39권5호
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• pp.502-510
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• 2006

2C-methyl-D-erythritol 2, 4-cyclodiphosphate synthase (MECPS, EC: 4.6.1.12) is the fifth enzyme of the non-mevalonate terpenoid pathway for isopentenyl diphosphate biosynthesis and is involved in the methylerythritol phosphate (MEP) pathway for ginkgolide biosynthesis. The full-length mecps cDNA sequence (designated as Gbmecps) was cloned and characterized for the first time from gymnosperm plant species, Ginkgo biloba, using RACE (rapid amplification of cDNA ends) technique. The full-length cDNA of Gbmecps was 874 bp containing a 720 bp open reading frame (ORF) encoding a peptide of 239 amino acids with a calculated molecular mass of 26.03 kDa and an isoelectric point of 8.83. Comparative and bioinformatic analyses revealed that GbMECPS showed extensive homology with MECPSs from other species and contained conserved residues owned by the MECPS protein family. Phylogenetic analysis indicated that GbMECPS was more ancient than other plant MECPSs. Tissue expression pattern analysis indicated that GbMECPS expressed the highest in roots, followed by in leaves, and the lowest in seeds. The color complementation assay indicated that GbMECPS could accelerate the accumulation of $\beta$-carotene. The cloning, characterization and functional analysis of GbMECPS will be helpful to understand more about the role of MECPS involved in the ginkgolides biosynthesis at the molecular level.

• Molecules and Cells
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• 제26권6호
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• pp.536-547
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• 2008

Anthocyanidin synthase (ANS, leucoanthocyanidin oxygenase), a 2-oxoglutarate iron-dependent oxygenase, catalyzed the penultimate step in the biosynthesis of the anthocyanin class of flavonoids, from the colorless leucoanthocyanidins to the colored anthocyanidins. The full-length cDNA and genomic DNA sequences of ANS gene (designated as GbANS) were isolated from Ginkgo biloba for the first time. The full-length cDNA of GbANS contained a 1062-bp open reading frame (ORF) encoding a 354-amino-acid protein. The genomic DNA analysis showed that GbANS gene had three exons and two introns. The deduced GbANS protein showed high identities to other plant ANSs. The conserved amino acids (H-X-D) ligating ferrous iron and residues (R-X-S) participating in 2-oxoglutarate binding were found in GbANS at the similar positions like other ANSs. Southern blot analysis indicated that GbANS belonged to a multi-gene family. The expression analysis by real-time PCR showed that GbANS expressed in a tissue-specific manner in G. biloba. GbANS was also found to be up-regulated by all of the six tested abiotic stresses, UV-B, abscisic acid, sucrose, salicylic acid, cold and ethylene, consistent with the promoter region analysis of GbANS. The recombinant protein was successfully expressed in E. coli strain with pET-28a vector. The in vitro enzyme activity assay by HPLC indicated that recombinant GbANS protein could catalyze the formation the cyanidin from leucocyanidin and conversion of dihydroquercetin to quercetin, suggesting GbANS is a bifunctional enzyme within the anthocyanidin and flavonol biosynthetic pathway.

• Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
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• 제16권9호
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• pp.3723-3727
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• 2015

The p53 tumor suppressor protein is a principal mediator of growth arrest, senescence, and apoptosis in response to a broad array of cellular damage. p53 is a substrate for the ubiquitin-proteasome system, however, the ubiquitin-conjugating enzymes (E2s) involved in p53 ubiquitination have not been well studied. UBE2Q1 is a novel E2 ubiquitin conjugating enzyme gene. Here, we investigated the effect of UBE2Q1 overexpression on the level of p53 in the MDA-MB-468 breast cancer cell line as well as the interaction between UBE2Q1 and p53. By using a lipofection method, the p53 mutated breast cancer cell line, MDA-MB-468, was transfected with the vector pCMV6-AN-GFP, containing UBE2Q1 ORF. Western blot analysis was employed to verify the overexpression of UBE2Q1 in MDA-MB-468 cells and to evaluate the expression level of p53 before and after cell transfection. Immunoprecipitation and GST pull-down protocols were used to investigate the binding of UBE2Q1 to p53. We established MDA-MB-468 cells that transiently expressed a GFP fusion proteins containing UBE2Q1 (GFP-UBE2Q1). Western blot analysis revealed that levels of p53 were markedly lower in UBE2Q1 transfected MDA-MB-468 cells as compared with control MDA-MB-468 cells. Both in vivo and in vitro data showed that UBE2Q1 co-precipitated with p53 protein. Our data for the first time showed that overexpression of UBE2Q1can lead to the repression of p53 in MDA-MB-468 cells. This repression of p53 may be due to its UBE2Q1 mediated ubiquitination and subsequent proteasome degradation, a process that may involve direct interaction of UBE2Q1with p53.

• 한국자원식물학회지
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• 제31권5호
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• pp.531-537
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• 2018

국내 재배종 마늘을 대상으로 상처(wound) 처리에 특이적으로 발현되는 Cyt. P450 cDNA (ORF 1,419 bp) 중 1,210~1,240 bp 사이에 존재하는 heme-binding domain (HB-domain)의 염기서열 다형성을 바탕으로 국내산 재배마늘의 HB-domain의 다형성 분포를 조사하였다. 국내 재배마늘에서 7개의 각각 다른 염기서열을 가진 HB-domain 마커를 탐색하였고, 전국 6개 지역의 재배농가에서 임의로 수집한 120개 마늘의 마커 종류별 분포도를 조사하였다. 경북, 충남, 충북, 강원지역에서 재배되는 한지형 마늘은 아미노산서열 FGGGRRICPG, DNA서열 5'-TTT/GGC/GGT/GGA/CGG/AGA/ATA/TGT/CCT/GGA-3'인 KP2형의 HB-domain을 가진 재배종이 51.3%로 가장 많이 분포하였고, KP1형 13.7%, CP형 11.3%, CM형 8.8%, KW2형 5% 및 기타 1.3%인 것으로 나타났다. 경남지역 재배지에서 수집한 난지형 마늘은 아미노산서열 FGAGRRICPG, DNA서열 '5-TTT/GGC/GCA/GGA/CGG/AGA/ATT/TGT/CCT/GGA-3'인 KM형이 52.5%로 가장 많았고, KP2형 22.5%, KW2형 5%, KP1 및 CP형이 각각 2.5%가 분포하는 것으로 나타났으나 CM형은 존재하지 않았다. 이 결과는 우리나라에 재배되는 마늘은 유전적으로 상당히 혼재된 상태로 존재하며, 특정 지역을 대표하는 유전적 특징을 가진 재배종을 단정하기는 어려운 것으로 판단된다.

• Journal of Ginseng Research
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• 제32권4호
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• pp.300-304
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• 2008

14년생 인삼의 뿌리로부터 cDNA library를 제작한 후 무작위로 뽑은 EST clone 중에서 cysteine proteinase(CP) 유전자에 높은 상동성을 나타내는 clone 6개를 선발하였고 이를 바탕으로 PgCysP1을 제작하였다. 인삼의 CP 유전자는 전장의 길이가 1,398bp로 366개의 아미노산을 코딩하는 1,101bp의 ORF를 가지고 있다. PgCysP1의 아미노산 서열과 이차구조를 분석한 결과, 기존에 보고된 식물들과 높은 상동성을 나타내었으며 PgCysP1는 papain family에 속하는 것으로 확인되었다. RT-PCR 분석결과, 인삼의 PgCysP1는 NaCl, 저온, wound, salicylic acid에 대해 그 발현 양상이 상동성을 나타내는 다른식물의 CP 유전자 발현과 유사한 양성을 보였고, 이에 PgCysP1은 CP gene으로 사료되며, 앞으로 인삼 식물체의 환경 스트레스에 대한 내성 연구가 요구된다.