The present experiment was carried out to study the pathogenesis of Newcastle disease by immunohisthochemistry and RT-PCR Two weeks aged specific pathogen-free chickens (White Leghorn) were inoculated with Newcastle disease virus(Kyojeongwon Strain : NDV) intranasally. (omitted)
뉴캣슬병은 19세기중엽부터 뉴캣슬병 (ND)의 발생이 있었던 것으로 추측하고 있으나 영국에서 1926년 Doyle$^{62}$ 에 의해서 처음으로 발생보고 된 이내 오늘에 이르기까지 ND는 세계적으로 널리 발생되고 있을 뿐만 아니라 앞으로도 거의 근절되지 않고 계독존재하면서 양계에 많은 피해를 줄 것으로 예상된다. 이와 같이 세계적으로 분포되어 있을 뿐만 아니라 많은 학자들은 이병과 이병의 원인체인 Newcastle disease virus(NDV)에 관한 연구가 이루어져 왔었다. (중략)
내장친화성 뉴캣슬병 바이러스 한국분리주의 분자역학적 분석 뉴캣슬병 바이러스 한국분리주의 유전자 염기서열과 아미노산 염기서열을 분석한 후 미국, 유럽, 일본, 대만과 중국 등지에서 보고된 뉴캣슬병 바이러스의 유전자와 비교분석을 실시하였다. 1949, 1982-1984, 1988-1997, 1995-2002년도에 분리된 뉴캣슬병 바이러스 한국분리주 들은 각각 유전자형 III, V, VI, VII형에 속하는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 다섯번의 한국 뉴캣슬병 유행기에 분리된 바이러스의 유전자형이 시대순으로 차례대로 III, V, VI, VII형으로 교체되어 왔음을 의미한다. 계통발생학적 분석 결과, 뉴캣슬병 바이러스 한국분리주중 V유전자형에 속하는 바이러스는 1970년대의 유럽 유행주와 관련성이 있는 반면, 1988년 이후 분리된 VI과 VII 유전자형의 바이러스는 일본, 대만, 중국과 같은 극동아시아의 뉴캣슬병 발생과 관련성이 높은 것으로 나타났다. 따라서 최근에는 극동아시아 유래의 VI과 VII유전자형이 한국분리주의 주류를 이루고 있으며, 이는 극동아시아 국가들간의 축산물과 사람의 교역 및 교류의 증가 때문인 것으로 보인다.
전염성기관지염 바이러스(infectious bronchitis virus: IBV), 조류 뉴모 바이러스(Avian pneumovirus: APV), 뉴캣슬병 바이러스 (Newcastle disease virus: NDV), 조류인플루엔자 바이러스(avian influenza virus: AIV) 전염성 후두기관염 바이러스 (infectious laryngotracheitis virus: ILTV)는 닭의 호흡기에 직접 감염하여 호흡기질환을 일으키는 대표적인 바이러스로 알려져 있다. 그 밖에 아데노바이러스(adenovirus)와 레오바이러스 (reovirus)도 닭의 상부호흡기에 침투하여 피해를 입히는 이차적 원인체로 작용할 수 있다. 이들중 APV와 ILTV는 닭의 호흡기도에 국한되어 증식하지만 IBV, NDV, AIV의 경우 호흡기도 이외의 장기에서 증식이 가능하여 그 피해가 다양하게 나타나 문제 시 되기도 한다 (예: 산란장기 및 신장 (IBV), 소화기 (NDV, IBV, AIV), 중추신경계 (NDV, AIV)). 이외에도 상당수의 감염성 질환이 닭의 호흡기에 영향을 미칠 수 있으나, 해당 농장의 호흡기 피해가 어떤 질병에 의한 것인지 명확히 파악하지 못한 채 단순 항생제 처방에만 의지하는 경우가 많은 것이 현실이다. 따라서 국내 양계농가에서 문제시되는 주요 호흡기 질병과 이들의 감수성을 증대시키는 요인을 파악하는 것이 필요하고, 호흡기 질병의 피해에 대한 재인식과 아울러 호흡기 질병 피해 감소를 위한 진단과 예방노력이 하루속히 정착되어야 할 것이다. 본지에서는 대표적인 호흡기 질병 세가지(전염성기관지염, 조류뉴모바이러스감염증, 뉴캣슬병)의 최근 발생동향과 그 대처방안에 대하여 소개하고자 한다.
Low pathogenic avian influenza (LPAI; H9N2) and Newcastle disease (ND) are economically important poultry diseases in Korea. In this study, we investigated pathological features and virus distribution in the lymphoid tissues of chicks experimentally infected with H9N2 and/or ND virus. Six-weeks-old SPF chickens were divided into 4 groups, Control (C), H9N2 (E1), NDV (E2), and H9N2+NDV (E3). E1 group was challenged with 0.1 ml A/Kr/Ck/01310/01 (H9N2) $10^{5.6}$$EID_{50}$ intranasally, E2 group was challenged with 0.5 ml KJW (NDV) $10^{5.0}{\sim}10^{6.0}$$ELD_{50}$ intramuscularly, and E3 group was challenged with H9N2, followed 7 days later by NDV. In histopathological examination, E1 group showed depletion and necrosis in bursa of Fabricius, thymus, cecal tonsil, and spleen, whereas E2 and E3 groups were noted severe lymphocyte depletion and necrosis with destruction of lymphoid organs structures. In TUNEL assay, apoptotic bodies were detected in lymphoid organs of all experimental groups, which was most severe in E3 group. H9N2 and ND viruses were predominantly detected in cecal tonsil of E1, E2, and E3 groups by PCR and immunohistochemistry (ICH). In conclusion, co-infection of H9N2 with NDV caused severe pathologic lesions and apoptosis in lymphoid tissues compared to single infections.
Newcastle disease (ND) is a highly contagious infection of poultry, Two pathology-based techniques, in situ RT-PCR and in situ hybridization (ISH) were applied to formalin-fixed, paraffin-embedded tissues from chickens naturally infected with velogenic ND virus (VNDV). Two pairs of primers and a probe for ISH and in situ RT-PCR, respectively, were selected from highly conserved region of matrix gene of NDV. The ISH experiment was carried out using MicroProbe$^{TM}$ capillary action system within 2 hours. In situ RT-PCR was performed using MicroProbe$^{TM}$ capillary action system and GeneAmp In Situ PCR system. With ISH and in situ RT-PCR, viral nucleic acid was detected in the central nervous system of chickens from infected with neurotropic velogenic Newcastle disease virus (NVNDV), whereas viral nucleic acid was detected in various organs or tissues of chickens from infected with viscerotropic velogenic Newcastle disease virus (VVNDV). In the NVND group, positive signals were characteristically defined in the cytoplasm of neuron, vascular endothelial cells, and perivascular mononuclear macrophages in the central nervous system. One of NVND group, chicken from one farm exhibited positive signals in the bronchial epithelium. The VVND group chickens showed positive reaction in the macrophages, vascular endothelium, and bronchiolar epithelium. Markedly, viral nucleic acid was detected in the macrophages of morphologically normal tissues which were peripheral or located in distant areas from lesions. The central nervous system of chickens infected with VVND virus had positive signals in the vascular endothelial cell, perivascular mononuclear macrophages and some neuron. The number and intensity of the positive cells by in situ RT-PCR were more and stronger, respectively, in comparison with those by ISH. Particularly, positive reaction was detected in macrophages infiltrating in cardiac muscle by in situ RT-PCR, but not obtained by ISH. Therefore, these results demonstrated that ISH is a rapid diagnostic method for detection of NDV and in situ RT-PCR can be used as an efficient method for detection of low viral load infection or subclinical viral infection of NDV.
본 연구에서 NDV의 L유전자와 F유전자를 표적 부위로 각각 제작한 primer 세트를 사용함으로써 하나의 PCR 튜브에서 NDV 검출(386 bp의 증폭 크기)과 함께 병원성 NDV(229 bp의 증폭 크기)를 동시에 감별 증폭할 수 있는 dRT-PCR 검사법을 개발하였다. 개발된 dRT-PCR검사법은 NDV를 특이적으로 검출하고, 병원성을 감별하였다. 특히 국내 병성감정 실시기관에서 적용 중인 기존의 RT-PCR 상용키트에서는 검출하지 못하는 class I NDV과 PPMV(class II 유전형 VI형)을 NDV를 검출함과 동시에 병원성 NDV도 감별가능하였다. 개발된 dRT-PCR 검사법의 검출 민감도는 약 $10^{3.0}EID_{50}/0.1mL$로 평가되었다. 또한 ND발생국의 야외 시료에 적용했을 때, NDV 공통항원 검출율은 94.4%였으며, 병원성 NDV 검출율은 100%이었다. 그러므로 본 연구에서 개발한 dRT-PCR 검사법은 의심축 사례에서 ND를 신속 정확하게 진단하는 데 유용할 진단 방법을 제공할 수 있을 것으로 판단된다.
Mean death time of inoculated embryonated egg is one of the methods to determine the virulence of the Newcastle disease viruses (NDV). Evaluation of tissue tropism of NDV in the host has been proposed as an another way to determine the pathogenicity of NDV based on the principal site of viral replication. To evaluate the tissue tropism among NDV, an immunohistochemistry(IHC) technique using monoclonal antibody was applied in one-day-old SPF chickens inoculated with different ND vaccine strains such as Ulster 2C, VG/GA and B1 viruses by eye drop instillation. The tissues used for this comparison were trachea, intestine, Harderian gland and cecal tonsil, which were collected at 0.5, 1, 2, 3, 5, 8, 10, 14 days post inoculation. Among test groups, chickens inoculated with B1 viurs, which is known to replicate in the respiratory system, have IHC positive staining mainly in the trachea and those inoculated with Ulster 2C have IHC positive staining mainly in the intestine. However, chickens inoculated with VG/GA strain have IHC positive staining in both the trachea and intestine. Therefore, a differences in tissue tropism among ND vaccine strains has been proved by the IHC technique. Based on this results, the IHC staining technique could be used to classify the NDV or to study the pathogenesis of NDV in chickens.
Newcastle disease virus(NDV) 감염된 baby hamster kidney(BHK) 세포에서 syncytium(합포체) 형성은 세포막 표면으로의 수송된 바이러스 당단백질 hemagglutinin-neuramidase(HN)에 의해 일어난다. HAU 값은 추출물의 농도가 25과 3.2 ug/mL 사이에서는 현저하게 감소하였으나, NDV 감염된 HAD(%)는 25 ug/mL 농도에서 광범위한 흡착능의 감소를 나타내 바이러스 당단백질의 세포내 생합성은 저해되지 않았다. 그러므로, 약용식물인 마황 메탄올 추출물이 바이러스 당단백질의 세포막으로의 수송과 함께 합포체 형성을 저해하여 항바이러스 작용을 하였다. 또한 마황 추출물의 저해활성을 조사한 결과 ${\alpha}$-glucosidase에 대한 추출물의 $IC_{50}$은 $18{\mu}g/mL$이었으며, ${\beta}$-glucosidase, ${\alpha}$-mannosidase, ${\beta}$-mannosidase에 대한 마황 추출물의 $IC_{50}$은 각각 60, 40, $150{\mu}g/mL$로 나타나 ${\beta}$-type glycosidases 보다 ${\alpha}$-type glycosidase에 대한 효소활성 저해능이 우수하였다. 따라서 $IC_{50}$농도에서는 세포내에서 당단백질 생합성은 저해되지 않으며 당단백질의 수송을 저해하는 것으로 판단되었으며 향후 항바이러스 관련 작용기작의 연구가 필요하다고 판단된다.
Periodic outbreaks of Newcastle disease (ND) caused by velogenic viscerotropic ND virus (vvNDV) has become a major concern in Korea nowadays. Throughout last epidemic, the winter season in 2000, most chicken flocks infected early, under 2-4 weeks of age, showed high mortality up to 50-100%. Serum samples collected from 201 breeder, 284 layer and 112 broiler chicken flocks were examined to evaluate the efficacy of various vaccination methods and programs routinely used for mass vaccination in the field poultry farms. Despite repeated live vaccination, most poultry flocks vaccinated by drinking water route using nipple water supply system failed to produce solid active immune response to NDV during the growing time. In the present study, we applied the spray vaccination technique using Ulvavac or Desvac sprayer to the experimental poultry flocks and examined the efficacy of live vaccination effects induced by it under field condition. Measurable antibody to NDV as well as early protection against vvNDV challenge were found in poultry flocks vaccinated by spray route. Further, we did not found significant post vaccination reactions caused by spray vaccination if properly administered. These data indicate that the spray vaccination will be safe and reliable mass vaccination method for the prevention of ND.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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