Neurospora crassa 를 카드뮴, 철, 망간, 난 등이 각각 첨가된 배지에서 배양할 경우 각 중금속들이 균사에 저장되는 것을 관찰하였다. 각 중금속들은 단백질에 결합되더 각기 다른 세포네 소기관에 축적되었고, 중금속이 첩가된 배지에서 생장한 균사는 서로 매우 상이한 단백질 분포 양상을 보여 주었다. 가드뮴을 제외한 중금속들은 예상과는 달리 N. crassa 의 성장을 억제하지 않았으며, 납의 경우는 우히려 성장을 촉진하였다. 카드뮴이 첨가된 배지에서 condiospore 는 정상적인 길이 성장을 하지 못하고 둥근 형태로 생장하였으며, 길이 생장을 하던 균사는 두께가 두꺼워짐이 관찰되었다.
Neurospora crassa는 성장이 끝나고 분화되는 과정에서 tyrosinase를 생산하며 아미노산류의 기질유사체, 반대사물질, 단백질 생합성 저해제 등에 의해 효소생산이 유도된다. 미생물 균체를 배양시키며 여러가지 유도물질을 사용하여 효소의 생합성을 유도시킨 결과 가장 적합한 유도물질은 cycloheximide였다. 이는 균체의 성장을 크게 저해하는 항생제의 일종이므로 효소 생합성을 최대화시키기 위한 최적의 농도가 존재하였으며, 유도물질의 농도가 일정한 경우에 효소 생산에 최적인 유도시간이 존재하였다.
Coenzyme Q는 지용성 퀴논 유도체로서 미토콘드리아의 내막과 원핵생명체의 세포막에 위치하는 전자전달계에서 전자 운반체로 이용되며 또한 항산화제의 기능도 갖는다. Coenzyme Q의 생합성에 관여하는 Saccharomyces cerevisiae의 coq4 유전자에 유사성을 나타내는 Neurospora crassa coq-4유전자를 클로닝하여 S. cerevisiae coq4 돌연변이체에서 기능적으로 발현하였다. 상보된 S. cerevisiae 균주들은 coenzyme $Q_{6}$의 생산능력을 회복하였으며 정상적인 성장률을 보였다. 또한 linoleic acid 및 linolenic acid와 같은 불포화지방산에 대한 낮은 감수성을 보였다. N. crassa의 COQ4 단백질은 39.7 kDa의 분자량을 갖는 347개의 아미노산으로 구성되어 있는 것으로 예상되며, S. cerevisiae의 Coq4p와 35%의 일치도 및 52%의 유사도를 보인다.
Arylsulfatase를 암호화하는 Neurospora crassa의 ars-1 유전자는 황의 결핍에 의해서 발현이 조절된다. lacZ 유전자에 연결된 ars-1 프로모터 (Pars)가 N. crassa RLM 35-35 a his-3 inl 균주에 형질전환되고, 유사 서열 재조합에 의한 단일 교차에 의해서 염색체의 his-3 부위로 도입이 되었다. 황이 결여된 Vogel의 배지에서 자란 균사로부터 $\beta$-galactosidase 활성이 측정되었다. $\beta$-galactosidase 활성은 derepression 조건으로 변환한지 14 시간 후에 최고치를 기록하였다. Microconidiation에 의해서 생산된 homokaryon에서 측정된 활성은 heterokaryon보다 17% 증가가 되었음을 보여주었다. 이 실험은 ars-1 프로모터의 발현율을 측정할 수 있는 한 방법을 제시한 것으로, 보다 수월한 ars-1 발현 조절 연구가 기능할 것이다.
Radioactive elements Li/sup +/, Rb/sup +/and Cs/sup +/ effect the period shortening in proportion to the higher concentration on the growth of Neurospora crassa. 1 mM LiCl presented the result of the period length 0.52 h shorter than average circadian rhythm 21.66 h. 1 mM RbCl reduced the period length 1.13 h than control period 21.89 h and 1 mM CsCl reduced 2.12 h than control period 21.89 h. In the equal concentration Cs/sup +/ had an extreme effect. Fatal doses of Li/sup +/, Rb/sup +/ and Cs/sup +/ are 20mM, 30mM and 20mM. In the fatal concentration Neurospora didn't develop more after 7 days and the formation of spores were not given in regular order. Circadian length of Neurospora decreased generally at the last cycle of the growth.
Coenzyme Q은 긴 isoprenoid 사슬을 갖는 quinone의 유도체이다. Coenzyme Q는 진핵생명체의 미토콘드리아의 내막과 원핵생명체의 세포막에 위치하는 전자전달계에 존재하는 지용성 물질이며, 또한 항산화제로의 기능도 갖는다. Coenzyme Q는 Saccharomyces cerevisiae의 호기적 성장에 필수적이며, coq 돌연변이체는 발효가 불가능한 탄소 원에서의 성장이 불가능하다. S. cerevisiae의 $coq^7$p 효소들과 유사성을 나타내는 단백질을 암호화하는 Neurcspora crassa cDNA를 효모의 발현 벡터에 삽입하였다. N. crassa COQ7의 예상 서열은 S. cerevisiae의 효소와 58% homology를 보였다. N. crassa $coq^{-7}$ 유전자의 S. cerevisiae $coq^7$ 형질전환체는 야생형 균주와 유사한 성장률을 보였다. 형질전환 균주들은 발효가 불가능한 탄소원인 글리세롤을 유일한 탄소원으로 배양하였을 경우에도 정상적인 성장을 나타냈다. 또한 불포화지방산인 linolenic acid를 성장 배지에 첨가하여도 야생형 균주와 유사한 생존율이 관찰되었다.
$\alpha$-Amylase (EC.3.2.1.1) of Neurospora crassa (ATCC9279) was cloned in E. coli HB101 using shotgun method, and the enzymes isolated from both N. crassa and E. coli were compared. Chromosomal DNA isolated from the spores of N. crassa was partially digested with PstI restriction endonuclease and rejoined to pBR322 which had been digested with the same enzyme. The resulting recombinant DNA were introduced into E. coli HB101 which had competancy by treating with $CaCl_{2}$. As the result, about 8000 colonies which showed tetracycline resistance were selected and two of the colonies which had 13.5Kb recombinant plasmid exhibit starch degrading activity on starch-containing plate when treated with D-cycloserine. $\alpha$-Amylases from both N.crassa and E. coli were isolated by using ammonium sulfate precipitation, DEAE-cellulose ion exchange column chromatography and Bio-Gel P150 gel foltration column. As the result, about 81.3 fold and 5.6 fold purifications in specific activities were obtained respectively, and specific activities of the gel filtrates were 6.1u/mg and 85u/mg respectively. The properties of both enzymes were compared and they showed quite the similar patterns in optimal temperature, optimal pH and had same molecular weight about 100,000 daltons on gel filtration method. Optimal temperatures for both enzymes were $70^{\circ}C$ and optimal pH were about 6 and 10.
Park, Gyung-Soon;Ryu, Young-Hyo;Hong, Young-June;Uhm, Han-Sup;Choi, Eun-H.
한국진공학회:학술대회논문집
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한국진공학회 2012년도 제42회 동계 정기 학술대회 초록집
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pp.476-476
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2012
Although plasma is an efficient means of microbial sterilization, mechanism of plasma effect on microorganisms still needs to be clarified. In addition, a limited number of studies are available on eukaryotic microorganisms such as yeast and fungi in relation to plasma application. Thus, we investigated cellular and molecular aspects of plasma effects on a filamentous fungus, Neurospora crassa by making use of argon plasma jet at atmospheric pressure. The viability and cell morphology of N. crassa spores exposed to plasma were both significantly reduced depending on the exposure time when treated in water. The intracellular genomic DNA content was dramatically reduced in fungal tissues after a plasma treatment and the transcription factor tah-3 was found to be required for fungal tolerance to a harsh plasma environment.
Neurospora crass에서 L-ascorbic acid 합성 효소는 mitochondria에 위치하며 배지에 D- glucono-${\gamma}$-lactone과 L-gluno-${\gamma}$-lactone을 첨가하였을 때 각각의 기질에 대한 효소 활성도가 증가함을 볼 수 있었다. 이 효소의 순수 분리에는 ammonium sulfate 분획, DEAE-Sepharose CL-6B 에 의한 이온 교환 크로마토그래피, Sephacryk S-200에 의한 gel filtrarion 크로마토그래피, Reactive yellow 3-agarose dye column 크로마토그래피 등의 방법들이 이용되었다. 그 결과 2.1%의 수율에 specific activity가 239.6배 증가되었다. Sephacryl S-200 gel filtration을 통해 본 이 효소의 분자량은 약 150,000 dalton 이었다. 그리고 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis를 실시하였을 때는 분자량이 약 75,000 dalton이었으므로 이 효소는 동일한 단위체로 구성된 이합체로 생각되었다. 이 효소의 최적 반은 pH는 9.0으로 나타났으며 D-glucono-${\gamma}$-lactone을 기질로 하였을때의 $K_m$값은 0.073이었다.
The most periodlengths($\tau$) of conidiation of Neurospora were shortened in the medium with Li$^+$, Rb$^+$, and Cs$^+$ under the blue or green light. The higher the concentration of the heavy metal elements are, the shorter the circadian lengths are. The largest differences between the maxima- and minima circadian lengths showed in the medium with LiCI, RbCl, and CsCI under the blue lights at 150 Lux, while the little differences of circadian lengths presented in 1 mM heavy metal elements at the 270Lux blue light. Li$^+$ under the blue light effected extremely much and in the order of Rb$^+$ and Cs$^+$ on the conidiation of Neurospora. Under the green lights at 270Lux, the smallest changes of the circadian lengths are resulted in the medium with heavy metal elements. The other way at the green light 150Lux, the conidiation is stimulated by lmM LiCI or RbCl for the average 0.71h and 0.29h longer than the periodlength of control 28.34h. The medium with Li$^+$ under the green light has less effect on the conidiation rhythm of Neurospora than with Rb$^+$ or Cs$^+$.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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