한국의 전통 대두발효식품인 청국장에서 혈전용해능이 우수한 미생물을 분리하였으며, 이를 동정한 결과 B.amyloliquefaciens D4로 명명하였다. 혈전용해효소의 대량분비를 위해 N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine을 사용한 돌연변이를 유도하여 B. amyloliquefaciens D4-7 변이주를 얻었으며, plasmin 1 U/ml 6.5배 정도의 높은 혈전분해능을 나타내었다. B. amyloliquefaciens D4-7는 분리대두단백배지에서 혈전용해효소 분비능이 가장 우수하였다. B. amyloliquelaciens D4-7가 생산하는 혈전용해효소의 최적 활성조건은 pH 10, 5$0^{\circ}C$이었고, pH 7.0 에서 pH 11 사이에서 상대적으로 안정하였으며, $50^{\circ}C$에서 30분간 방치하였을 경우 50%의 활성이 유지되었다. 또한, NaCl, glycerol 또는glucose 첨가에 의해 혈전용해효소의 저장안정성이 높아지는 것을 확인할 수 있었다.
본 연구는 효모의 killer toxin을 포도주 발효효모에 도입시켜 발효중 다른 야생효모의 생육을 억제함으로서 starter를 절감하고 발효기간을 단축시키는 보다 효율적인 발효균주를 개발하기 위하여 수행되었다. 포도주 효모 Saccharomyces cerevisiae M524 균주에 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine을 처리하여 3종의 영양요구 변이주$CHM2(thr^-),\;CHM3(asp^-),\;CHM6(tyr^-)$를 만들었고, 이 변이주 각각을 killer 효모인 S. cerevisiae 1368R $({\alpha}\;his\;4\;kar\;1-1[kil-K][K_0]$, respiratory deficient)과 세포융합시켜 4종의 융합주 $CHF21(thr^-kil^+)\;CHF22(thr^-\;kil^+)\;CHF31(asp^-\;kil^+)\;CHF61\;(tyr^-\;kil^+)$을 만들었다. 이중 CHF31 융합주를 killer 효모 1368R과 killer 감수성 효모 S. cerevisiae $5{\times}47$에 각각 혼합 배양한 바 CHF31이 killer로서의 특성과 모균주에 못지 않은 ethanol 생성능을 지녔음이 확인되었다.
변이원물질인 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, $benzo{(\alpha)}pyrene,$ 3-amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido[4,3-b] indole에 대한 컴프리의 생즙과 가열즙의 항돌연변이 효과를 spore rec-assay 및 Ames test방법을 이용하여 검토하였다. Bacillus subtilis $H17(rec^+)$와 $H45(rec^-)$를 사용한 spore rec-assay에서 comfrey의 생즙시료 $40{\mu}l$처리시에 MNNG에 대한 강한 항돌연변이 효과를 나타내었다(p<0.01). Salmonella typhimurium TA98과 /TA100의 두 균주를 이용한 Ames test에서는, comfrey생즙의 경우 $B{(\alpha)}P$에 대해 TA98과 TA100 두균주 모두에서 각각 43% 및 52%의 다소 낮은 항돌연변이 효과를 나타낸 반면, 가열즙의 경우 Trp-P-1에 대해 TA98과 /TA100의 균주에 대해서 각각 75% 및 76%의 강한 항돌연변이 효과를 나타내었다(p<0.01).
L.casei YIT 9018균주에 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine을 처리하여 thermoinducible mutants를 분리하였고, 이 균주를 $42^{\circ}C$에서 30분 동안 열처리하여 prophage가 cured된 균주 L.casei HYM 1213과 L.casei HYM 4024를 분리하였다. Prophage cured strain L.case HYM 1213과 L.casei HYM 4024는 temperate phage $\phi$Fsw에 대해 지시균으로서 능력을 가지고 있었으며, 어떤 온도에서도 temperate phage $\phi$FSW가 검출되지 않았다. 이들의 생리적 특성을 모균주인 L.caseiYIT 9018과 비교한 결과 L.casei HYM 1213 균주는 균의 증식, pH변화, 산생성능력, 당 발효능력에서 모균주와 유사한 것으로 나타났으나, L.casei HYM 4024균주는 pH변화와 산생성능력이 모균주에 비해 미약한 것으로 나타났다. Plasmid DNA는 두 균주 모두 모균주와 동일한 size를 보여주여, prophage가 cured되었어도 plasmid DNA에는 손실을 가져오지 않았음을 알 수 있었다.
Talaromyces luteus 6112 균주에 돌연변이원 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine을 처리하여 고온성 돌연변이주인 T. luteus 2004를 선별하였다. T. luteus 2004 균주는 고온성 섬유소 분해 효소인 carboxymethylcellulase(CMCase)와 그 외의 다당류 분해효소인 avicellase, xylanase, ${\beta}-glucosidase$ 등을 생성하였다. 고온성 섬유소 분해효소의 생성은 3% carboxymethylcellulose(CMC) 최소배지에서 가장 높게 유도되었으므로 CMC가 CMCase 생성의 유도물질임을 알 수 있었다. 고온성 섬유소분해효소의 생성에 있어서 포도당과 D-cellobiose는 CMCase 생성에 catabolite repressor로 작용함을 보여 주었다. T. luteus 2004의 섬유소 분해효소의 효소학적 특성은 $70^{\circ}C$, pH 4에서 최고의 활성을 보여주는 고온성 효소이므로 대체에너지 개발에 활용 가능한 균주로 사료된다.
Trichoderma reesei QM 9414를 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine으로 처리하여 얻은 돌연변이주들을 여러 탄소원에서 배양했을 때 carboxymethylcellulose(CMC), fiter paper 등의 기질에 대한 활성측정결과 다음과 같은 결과를 얻었다. 모균주가 catabolite repression을 받는 반면에 돌연변이주들의 cellulase 활성은 glucose를 탄소원으로 사용한 배지에서 모균주에 비해 CMCase 8.4배, FPase가 $5.4{\sim}5.7$배 증가함으로써 glucose-derepression성질을 갖는 돌연변이주들을 얻었으며 glucose를 탄소원으로 사용하고 lactose로 효소의 생산을 유도시켜본 결과 모균주에 비해 효소의 생산에 안정성을 갖는 것으로 나타났으며 돌연변이주 1이 상대적으로 더 우수한 돌연변이주로 나타났다. 돌연변이주들에 의해 생산된 효소는 모균주와 마찬가지로 pH 4.8, $60^{\circ}C$에서 최적활성을 나타내었다.
감잎 열수 추출물 및 감잎 탄닌의 항돌연변이 효과를 Ames test, spore rec assay 및 SOS chromotest 방법을 이용하여 검토하엿다. Salmonella typhimurium TA100에서 aflatoxin $B_{1}(AFB_{1})$, dimethyl-amino-biphenyl(DMAB)와 같은 간접 돌연변이워에 대해서 뿐만아니라 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG), 4-nitroquinoline-1-oxide(4-NQO)와 같은 직접 돌연변이원에 대해서도 강력한 항돌연변이성을 관찰할 수 있었다. Bacillus subtilis H17($rec^{+}$)와 M45($rec^{-$)를 사용한 spore rec assay에서도 감잎 탄닌은 MNNG에 대한 강한 항돌연변이 효과를 나타내었고, Escherichia coli PQ37을 사용한 SOS chromotest에서도 4-NQO의 돌연변이성이 크게 저해되었다. 또한 감잎차 부터 탄닌을 추출하여 이미 그 효과가 알려진 녹차 탄닌과 함께 항돌연변이 효과를 살펴본 결과 시료의 농도에 비례해서 녹차탄니과 비슷한 수준으로 현저한 항돌연변이 효과를 나타내었다. 이들 항돌연변이 실험계에서 감잎 탄닌이 감잎 열수 추출물에 비해 활성이 크게 나타났다.
생물 계면활성제의 개발을 위해 MNNG(N-Methyl-N-Nitro- Nitrosoguanidine), EMS, UV radiator random mutation을 통해 가장 우수한 biosurfactant 생산 균주를 선별하였는데 MNNG를 처리한 균주가 유화활성 1.950, 표면장력 29.0dyne/cm으로 공시균주인 Pseudomonas aeruginosa EL-MS 유화활성 0.456과 표면장력 33.0dyne/cm에 비해 우수하였다.
4-nitroquinoline 1-oxide (4-NQO)와 N-methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidinein (MNNG)에 의해 유도된 돌연변이원성에 대한 결명자 물 추출물의 억제효과를 E. coli PQ37 이용한 SOS Chromotest법으로 검색하였다. $100{\mu}g$/assay 농도에서 4-NQO와 MNNG의 변이원성에 대한 결명자 물 추출물의 변이원성 억제 효과는 27.5 및 40%로 나타났다. 결명자 물 추출물을 메탄을 가용성 부분과 메탄을 불용성 부분으로 분리하여 4-NQO와 MNNG의 변이원성에 대한 억제효과를 검색한 결과 메탄을 가용성 부분이 더 강한 효과를 나타내었다. 따라서 결명자 메탄을 가용성 부분을 에틸아세테이트, 부탄을 그리고 물로 각각 분획하여, 4-NQO 및 MNNG에 대한 돌연변이 억제효과를 검색한 결과 물 분획물은 각각 19.0, 및 23.0% 억제효과로 가장 강하게 나타내었으며, MNNG의 변이원성에 대한 억제효과가 4-NQO의 변이원성에 대한 억제효과보다 더 강하게 나타남을 확인하였다. 결명자 열수추출물의 메탄을 가용성부분의 물 분획물의 농도를 assay당 1.0, 10, 100 및 $250{\mu}g$으로 증가시켰을 경우, 항돌연변이 효과는 각각 8.0%, 12.0%, 25.5%및 43.0%로 나타났다. 이러한 결과로부터, 결명자 물 분획물은 MNNG의 변이원성에 대하여 용량 의존적 억제효과를 나타냄을 확인하였다.
곰팡이 Gibberella fujikuroi ATCC12616을 mutagen N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine과 hydroxylamine으로 처리하여 지베렐린 생산수률이 가장 높은 변이주 G. fujikuroi G-26을 선별하였다 변이주 G.fujikuroi G-36는 모균주 G.fujikuroi ATCC 12616 과 비교하여 볼 때 지베렐린 생산수율이 약 32% 향상된 것으로 관찰 되었다 이 균주를 액체배지에서 발효시키면 주 탄소원으로 sucrose를 사용할 때 높은 생산성을 나타내었으며 초기배지 pH와 온도는 각각 pH 4.0$ 28^{\circ}C$조건이 가장 좋았다 배양온도를 $30^{\circ}C$에서 3일 배양후 $20^{\circ}C$로 낮추어 7일간 배양하면 130mg/l의 가장 높은 지베렐린이 생성됨을 알았다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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