• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제14권1호
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• pp.13-19
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• 2010

We developed a novel dicistronic system for the expression of target cDNA sequences in the milk of transgenic animals using goat beta-casein/hGH fusion construct, pGbc5.5hGH (Lee, 2006) and internal ribosome entry site (IRES) sequences of encephalomyocarditis virus (EMCV). Granulocyte colony-stimulating factor (hG-CSF) cDNA was linked to 3' untranslated region of hGH gene in the pGbc5.5hGH via EMCV IRES sequences. Transgenic mice were generated by microinjection and transgene expression was examined in the milk and mammary gland of transgenic mice at 10 days of lactation. Northern blot analysis showed that hGH gene and hG-CSF cDNA were transcribed as a single dicistronic mRNA. The hG-CSF and hGH proteins were independently translated from the dicistronic mRNA and secreted into the milk of transgenic mice. The highest concentration of hG-CSF and hGH in the milk of transgenic mice were $237{\mu}g/m{\ell}$ and $8,990{\mu}g/m{\ell}$, respectively. In contrast, another hG-CSF expression cassette, in which hG-CSF genomic sequences were inserted into a commercial milk-specific expression vector (pBC1), generated a lower level ($91{\mu}g/m{\ell}$) of hG-CSF expression in the milk of transgenic mice. These results demonstrated that the novel pGbc5.5hGH-based dicistronic construct could be useful for an efficient cDNA expression in the milk of transgenic animals.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제30권3호
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• pp.328-337
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• 2017

Objective: An experiment was conducted to determine the relationship between the KAP11.1 and the regulation wool fineness. Methods: In previous work, we constructed a skin cDNA library and isolated a full-length cDNA clone termed KAP11.1. On this basis, we conducted a series of bioinformatics analysis. Tissue distribution of KAP11.1 mRNA was performed using semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis. The expression of KAP11.1 mRNA in primary and secondary hair follicles was performed using real-time PCR (real-time polymerase chain reaction) analysis. The expression location of KAP11.1 mRNA in primary and secondary hair follicles was performed using in situ hybridization. Results: Bioinformatics analysis showed that KAP11.1 gene encodes a putative 158 amino acid protein that exhibited a high content of cysteine, serine, threonine, and valine and has a pubertal mammary gland) structural domain. Secondary structure prediction revealed a high proportion of random coils (76.73%). Semi-quantitative RT-PCR showed that KAP11.1 gene was expressed in heart, skin, and liver, but not expressed in spleen, lung and kidney. Real time PCR results showed that the expression of KAP11.1 has a higher expression in catagen than in anagen in the primary hair follicles. However, in the secondary hair follicles, KAP11.1 has a significantly higher expression in anagen than in catagen. Moreover, KAP11.1 gene has a strong expression in inner root sheath, hair matrix, and a lower expression in hair bulb. Conclusion: We conclude that KAP11.1 gene may play an important role in regulating the fiber diameter.

• Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
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• 제13권8호
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• pp.4113-4117
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• 2012

Breast cancer is a prevalent heterogeneous malignant disease. Gene expression profiling by DNA microarray can classify breast tumors into five different molecular subtypes: luminal A, luminal B, HER-2, basal and normal-like which have differing prognosis. Recently it has been shown that immunohistochemistry (IHC) markers including estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR) and human epidermal growth factor receptor 2 (Her2), can divide tumors to main subtypes: luminal A (ER+; PR+/-; HER-2-), luminal B (ER+;PR+/-; HER-2+), basal-like (ER-;PR-;HER2-) and Her2+ (ER-; PR-; HER-2+). Some subtypes such as basal-like subtype have been characterized by poor prognosis and reduced overall survival. Due to the importance of the ER signaling pathway in mammary cell proliferation; it appears that epigenetic changes in the $ER{\alpha}$ gene as a central component of this pathway, may contribute to prognostic prediction. Thus this study aimed to clarify the correlation of different IHC-based subtypes of breast tumors with $ER{\alpha}$ methylation in Iranian breast cancer patients. For this purpose one hundred fresh breast tumors obtained by surgical resection underwent DNA extraction for assessment of their ER methylation status by methylation specific PCR (MSP). These tumors were classified into main subtypes according to IHC markers and data were collected on pathological features of the patients. $ER{\alpha}$ methylation was found in 25 of 28 (89.3%) basal tumors, 21 of 24 (87.5%) Her2+ tumors, 18 of 34 (52.9%) luminal A tumors and 7 of 14 (50%) luminal B tumors. A strong correlation was found between $ER{\alpha}$ methylation and poor prognosis tumor subtypes (basal and Her2+) in patients (P<0.001). Our findings show that $ER{\alpha}$ methylation is correlated with poor prognosis subtypes of breast tumors in Iranian patients and may play an important role in pathogenesis of the more aggressive breast tumors.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제32권3호
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• pp.153-158
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• 2008

형질 전환 동물 생산에는 조직 및 시기 특이적 발현 조절이 가능하다는 장점 때문에 유즙 내로 외부 유전자를 발현시키는 시스템이 널리 이용되고 있다. 유전자 발현 즉, 단백질 생산은 프로모터의 강도뿐만 아니라 mRNA의 안정성에 의해서도 조절된다. 특히, polyadenylation에 의한 poly A의 길이는 in vivo와 올 in vitro에서 mRNA 안정성 및 목적 유전자의 번역효율에 영향을 준다. 본 연구에서는 이러한 mRNA 안정성이 목적 유전자의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 3'-UTR 염기 서열을 분석하였다. 이 3'-untranslated region(UTR) 내의 poly A signal을 기준으로 putative cytoplasmic polyadenylation element(CPE) 부위와 downstream elements(DSE: U-rich, G-rich, GU-rich)의 염기 서열을 분석하고, 각각의 element를 기준으로 15 종의 luciferase reporter vector를 제작하여, 생쥐 유선 세포주(HC11)와 돼지 유선 세포주(PMGC)에 각각 transfection시킨 후 48시간 동안 배양하고 luciferase 발현량을 분석하였다. PMGC의 경우, luciferase의 발현은 exon 9의 CPE 2,3 및 DSE 1을 포함한 #6 construct에서 유의적으로 높은 발현량을 보였으며, exon 9의 CPE 2, 3과 DSE를 모두 포함하고 있는 #11 construct에서도 유의적으로 높은 발현량을 보였다. 이러한 결과는 형질 전환 돼지 생산에 있어 #6 및 11 construct의 사용은 목적의 유전자를 효과적으로 발현시키는데 기여할 것으로 사료된다.

• 대한수의학회지
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• 제45권1호
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• pp.45-53
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• 2005

GroE that is a heat shock protein composed of GroEL and GroES is known as an immunodominant target of both the humoral and cellular immune responses in bovine brucellosis. This study was carried out to characterize groE gene encoding heat shock proteins of B. abortus isolated in Korea and to evaluate the immunogenicity of the GroE protein expressed in E. coli system. In PCR the specific signals with the size of 2,077 bp were detected in five strains isolated from the mammary lymphnodes of the dairy cattle that were serologically positive and the reference strains. In comparison of the sequences of nucleotides and amino acids among the strains, GroES showed 100% identity in both sequences. GroEL was evaluated 99.0~99.9% in nucleotides and 98.0~100% homology in amino acids. The groE gene including groES and groEL was inserted into pET29a vector and constructed pET29a-GroE recombinant plasmids. The inserted groE was confirmed by digestion with Nco1 and EcoR1 endonucleases and nucleotide sequencing. E. coli BL (DE3) was transformed with pET29a-GroE, named as E. coli BL (DE3)/pET29a-GroE. In SDS-PAGE, it was evident that the recombinant plasmid effectively expressed the polypeptides for GroES (10 kDa) and GroEL (60 kDa) in 0.5, 1 and 2 hours after IPTG induction. The immuno-reactivity of the expressed proteins were proved in mouse inoculation and Western blot analysis.

• 생명과학회지
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• 제26권3호
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• pp.275-281
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• 2016

인체치료용 당단백질은 바이오의약품에 있어서 중요한 요소이며 특히, 단백질 말단에 결합되어있는 시알산은 의약품의 체내 활성이나 안정성에 큰 영향을 미친다. 최근 돼지유즙은 바이오의약품을 생산하기 위한 생체반응기로써 주목받고 있다. β-1,4-N-acetylglucosaminyltransferase A (MGAT4A)는 재조합단백질이 가지는 시알산 함량을 늘리기 위한 필수 효소 중 하나이다. 그러나 돼지 MGAT4A는 아직도 그 서열이나 기능이 불분명하다. 따라서 이번 연구에서는 돼지 MGAT4A의 서열 동정 및 기능분석을 하였다. 돼지 MGAT4A는 535개의 아미노산을 코딩하는 1,638개의 염기서열로 이루어져 있으며, 일반적인 당전이효소들의 특징인 type II membrane topology의 특성을 가지고 있다. Real-time PCR분석법을 통하여, 지금까지 알려진 것과는 조금 다르게 MGAT4A 유전자가 간이나 유선에서 많은 발현을 보였으나 소장이나 위, 방광에서는 그 발현량이 적다는 것도 확인하였다. 또한, 효소의 기능 분석을 위하여 PK-15 세포주에서 MGAT4A효소의 과발현을 유도하였다. 과발현이 확인된 세포주로 렉틴을 이용한 면역형광염색법과 ELISA방법으로 MGAT4A효소의 과발현이 β-1,4-N-acetylglucosamine의 함량을 증가시켰음을 확인하였다. 또한 기질반응을 통해 bi-antennary structure에 대한 반응성도 확인하였으며, MGAT4A의 과발현이 유도된 세포에서 약 3배 이상의 높은 기질 반응성을 보였다. 이러한 연구는 생체반응기로써 돼지를 이용하는데 있어서 중요한 기반이 될 것이라고 생각한다.

• 한국잠사곤충학회지
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• 제49권2호
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• pp.37-42
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• 2007

락토페린 cDNA 유전자를 도입시킨 누에 형질전환 실험을 수행한 결과, 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 1. 사람 GI-101 세포주의 mRNA로부터 클로닝 된 락토페린 cDNA 유전자의 개시코돈 ATG와 종결코돈 TAA를 포함하는 open reading frame(2,136 bp) 영역을 확인하였다. 2. Sf9 배양세포의 조추출물 시료에 의한 Western blot 분석 결과, 락토페린으로 추정되는 약 80kDa의 단백질 발현을 확인하였다. 3. 누에 형질전환에 높은 전이효율과 활성을 나타내는 트랜스포존을 이용한 전이벡터 pPIGA3GFP를 개조하여 락토페린 cDNA를 삽입시킨 전이벡터 pPT-HLf를 구축하였다. 4. DNA 미량 주사법에 의한 누에 형질전환 개체의 발현 비율은 약 6.7% 정도를 나타냈다. 5. 형질전환 누에(G0) 동일한 세대간 교배 및 처리하지 않은 성충간의 역교배에 의한 차세대(G1) 개체로부터 락토페린 유전자와 동일한 크기의 2.1 kb DNA 단편을 확인 할 수 있었으며, 형질전환 G1 세대의 조추출물 시료에 의한 Western blot 분석 결과, 표준 락토페린 항체와 반응하는 약 80 kDa의 단백질 발현을 확인할 수 있었다.

• Journal of Animal Science and Technology
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• 제45권5호
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• pp.703-710
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• 2003

본 연구는 재래돼지와 랜드레이스를 기초축으로 이용한 F$_2$ 241두에 대해 Heart Fatty Acid- Binding Protein 유전자와 연관되어 있는 PCR- RFLP를 이용하여 그 다형성을 조사하고 돼지의 성장형질, 도체형질, 육질형질과 그 유전자형간의 연관성을 구명코자 실시하였다. H-FABP PCR-RFLP는 두 쌍의 primer에 의한 850bp와 700bp의 증폭산물을 HaeⅢ와 HinfⅠ제한효소를 사용하여 실시되었다. HaeⅢ을 이용한 PCR-RFLP 유전자형은 DD형/700+150bp, Dd형/700+400+300+ 150bp 그리고 dd형/400+300+150bp의 DNA 단편을 보였으며, Hinf1에 의한 유전자형은 HH형은 350+180+130bp, Hh형은 350+220+180+130bp, hh형/350+220+130bp의 절단된 DNA 단편을 보였다. H-FABP/HaeⅢ 유전자형 중에서 12주령 체중은 DD형에 비해 Dd와 dd형에서 유의적으로 높은 값을 보였으며(p〈0.001), 3주령 체중 (p〈0.01)과 5주령, 30주령 체중 (p〈0.05)에 경우도 Dd와 dd형에서 유의적으로 높게 관찰되었고(Table 3), 특히 ‘d’ 대립유전자가 체중과 연관성이 있음이 관찰되었다. H-FABP/HinfⅠ의 유전자형과 표현형질의 연관성을 보면 12주령, 30주령 체중 및 도체지방 과 등지방 두께에서는 hh형에 비해 HH와 Hh형에서 유의적으로 높게 나타났으며(p〈0.001), 5주령 체중과 근내지방 함량에서도 HH형에서 유의적으로 높게 관찰되었고(p〈0.05), 특히 ‘H’ 대립유전자가 체중과 도체지방, 등지방 두께 및 근내지방 함량과 연관성이 있음이 관찰되었다. 따라서 돼지성장 및 지방축적과 관련한 선발력을 높이기 위해 H- FABP PCR-RFLP(HaeⅢ & HinfⅠ)를 분자생물학적 marker로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.