오매 추출물 첨가 사료의 투여가 양식 뱀장어의 비특이적 면역 반응에 미치는 효과를 조사하였다. 그 결과, 뱀장어의 혈청 내 lysozyme의 활성을 증가시키는 것으로 나타났고, 점액 내 lysozyme 및 혈청의 살균능에 있어서는 차이를 나타내지 않았다. 혈청 내 lysozyme의 활성은 추출물 첨가 사료 투여 후 2주째에 증가하기 시작하여 5주째에 가장 높은 것으로 나타났다. 어류 병원성 세균인 Edwardsiella tarda와 Aeromonas hydrophila 균에 대한 저항성 실험에 서 오매 추출물 첨가 사료을 투여한 실험구가 대조구에 비해 세균에 대한 저항성이 높게 나타났다. 또한 오매 추출물 첨가 사료를 투여한 실험구에서 대조구에 비해 성장이 좋게 나타났다.
고온 혐기성 Clostridium thermocellum 및 Clostridium thermohydrosulfuricum의 원형질체 형성 및 재생조건에 대하여 조사하였다. 원형질체 형성은 C. thermocellum의 경우, 0.2% glycine을 첨가한 배지에서 초기대수증식까지 생육한 cell을 0.5mg/ml의 lysozyme을 함유한 100mM TMG buffer(pH 7.5)에서 $37^{\circ}C$, 2시간 처리 했을 때 가장 좋았으며, C. thermohydrosulfuricum은 대수증식기의 cell을 동일 조건에서 0.2mg/ml의 lysozyme으로 처리했을 때 양호하였다. 원형질체 재생은 0.3-0.4M sorbitol. 0.5% casamino acid, 고농도의 $CaCl_2$를 첨가한 재생배지에서 $60^{\circ}C$, 7-10일간 배양했을 때 잘 되었으며, 원형질체 형성시 lysozyme의 처리 시간이 짧을 수록 좋았다. 재생빈도는 C. thermocellum의 경우 $4.85{\times}10^{-3}$, C. thermohydrosulfuricum의 경우 $4.23{\times}10^{-2}$ 이하로 낮은 편이었다. 재생배지에 나타난 colony에는 완전히 재생되지 않은 L-form cell도 함께 존재하였다.
The immune system in teleost fish is not completely developed during embryonic and larval stages, therefore effective innate mechanisms is very important for survival in such an environment. However, the knowledge of the development of immune system assumed to be restricted. In many species, lysozymes have been considered as important genes of the first line immune defense. The early detection of lysozyme mRNA in previous reports, led to the investigation of its presence in oocytes. As a result, c-type lysozyme mRNA transcripts were detected in unfertilized oocytes indicating maternal transfer. Therefore, we investigated the expression patterns of lysozymes in flounder, including the matured oocyte. In our results, c-type lysozyme mRNA was first detected in unfertilized oocyte stage, observed the significantly decreased until hatching stage, and was significantly increased after hatching stage. On the other hand, g-type lysozyme mRNA transcripts were first detected at late neurula stage, and the mRNA level was significantly increased after 20 dph. It may be suggest that maternally supplied mRNAs are selectively degraded prior to the activation of embryonic transcription. This study will be help in understanding the maturation and onset of humoral immunity during development of olive flounder immune system.
The activity change of lysozyme resulted from its exposure to $Ti-H_2O_2$system in aqueous liquid at room temperature and to ${\gamma}$-irradiation in ice at $195^{\circ}K$ has been measured at room temperature with a Cary-14 spectrophotometer. The enzymatic activity of lysozyme which had been added to a previously flow-mixed solution of $TiCl_3$ and $H_2O_2$ (System I) was compared with the activity of a lysozyme-$H_2O_2$ solution after flow-mixing with $TiCl_3$ (System II), considering the differences between these two activity changes as the extent of the enzymatic inactivation by the involvement of OH radical reaction. The fraction of lysozyme inactivated by OH radical in the system containing 0.0025 M $TiCl_3-0.1M$$H_2O_2$ (ph 3.5) was 13%, When the $TiCl_3$ concentration is double (pH 3.0), the fraction of enzyme inactivated increases to 36%. The activity of the system containing 0.025 M $TiCl_3-0.1$ M $H_2O_2$ (pH 1.5) was essentially zero. The results seem to support the previos view that the production of OH radical should be proportional to $TiCl_3$ concentration when $H_2O_2$ is present in excess. Increase in the extent of inactivation found in system I with increasing $TiCl_3$ concentration may be due to a pH effect. $H_2O_2$ seems to be less effective than $TiCl_3$ in the inactivation. 1% lysozyme solution, when ${\gamma}$-irradiated with a total dose of 3M rads, loses about 20% of its activity. Lowering of temperature also was found to yield a reduction in enzymatic activity.
The recombinant lysozyme-HJL34 proteins were expressed and purified using commercial Escherichia (E.) coli expression system. Stx2e+ F18+ E. coli, Actinobacillus pleuropneumoniae (APP), Streptococcus (S.) suis, and Clostridium (C.) perfringens strains were isolated from pigs. The minimum inhibitory concentrations (MICs) of the recombinant lysozyme-HJP34 proteins were examined by means of the microtiter plate method, according to the NCCLS recommendations. The possibility of its as the alternatives to antibiotics was tested in piglets. The MICs were determined as 75 ㎍/mL, 300 ㎍/mL, 75 ㎍/mL, 35.5 ㎍/m against Stx2e+ F18+ E. coli, APP, S. suis, C. perfringens, respectively. A total of 25 piglets were divied 5 groups. The piglets in group A~C were fed with commercial feed and those in groups D, E were fed with commercial feedstuff. All piglets in groups B~E were challenged with virulent Stx2e+ F18+ E. coli, APP, S. suis strains. Groups C and D were treated with antimicrobial from 24 h after challenge. All piglets in group B died within 3 days after challenge. Among 5 piglets in groups C and D piglets, 80% survived after challenge. Among group E piglets, 60% were alive until the end of this study. Therefore, this study indicates that recombinant lysozyme-HJP34 proteins is a suitable possibility as a feed additive for reduction of diseases by bacterial pathogens in piglet feed.
라이소자임은 선천성 면역 물질로 개불을 포함하는 여러 무척추동물의 병원균에 대한 방어에 주요하게 작용한다. 본 논문은 개불(Urechis unicinctus)의 체벽 조직 추출물로부터 무척추형 라이소자임의 정제와 그 특성에 관한 분석을 기술하고 있다. 체벽 추출물은 우선적으로 Sep-Pak C18 cartridge를 사용하여 부분적으로 분리되었으며, 분리된 분획 중 60% 메탄올에 용출된 분획이 Bacillus subtilis KCTC 1021에서 강한 항균활성을 나타내었다. 그 후 여러 단계의 역상과 이온교환 고속액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 사용하여 항균성 물질이 정제되었으며, 분자량은 약 14 kDa이었다. 이 단백질의 일차서열은 LC-MS/MS를 통해 분석되었으며, 얻은 부분적 아미노산 서열을 NCBI BLAST를 통하여 분석해 본 결과, 이 항균성 물질은 다른 동물들로부터 동정된 무척추동물형 라이소자임(invertebrate-type lysozyme)의 서열과 유사도를 가지고 있어, 체벽으로부터 정제된 개불 라이소자임(Urechis unicinctus invertebrate-type lysozyme from body wall, Uu-iLysb)으로 명명하였다. 개불 라이소자임의 활성을 확인하기 위하여 항균활성 및 라이소자임 효소 활성실험을 진행한 결과, 개불 라이소자임이 항균활성과 라이소자임 효소활성 모두 강하게 가지고 있는 것을 확인하였다.
Liposome내에 효소를 포집시켜서 식품가공공정에 응용하기 위하여 모델 효소로서 Iysozyme을 선택하여 dehydration-rehydration법으로 미세캡술화시킬 때 조제 조건이 포집효율에 미치는 영향을 검토하고 외부 환경 인자의 변화 및 유출 촉진제의 첨가가 liposome 내의 효소의 유출에 미치는 영향을 연구하였다. MLV 현탁액을 bath sonicator에서 100 kHz로 2시간 초음파 처리했을 때 1ozyme의 포집효율이 90.9%로 가장 높았다. 초기 효소 첨가량을 증가시킴으로써 단위 지방질당 포집 효소량은 거의 비례적으로 증가하였으나 포집효율은 감소하여 1osozyme 50 mg/100 mg soy lecithin일 때 68% 수준까지 급격히 감소하였으나, 그 이상의 실험농도 범위에서는 매우 완만하였다. 효소를 포집한 liposome은 $37^{\circ}C$, pH 5.9에 저장하였을때에 가장 안정하였고 산성일수록 유출속도는 현저히 증가하였으며 일정한 속도로 지속적으로 유출되었다. Tween 80 1.0%와 흔합했을 때 초기 24시간 동안에는 급격히 유출되었으나 시간이 경과할수록 완만히 유출되어 72시간 경과 후 85%까지 유출되었다. 또한 $Ca^{2+}$ ion을 25-5OmM첨가했을 때 초기 1시간동안 급격히 유출되었으나 그 이후에는 완만히 유출되었다.
대한약학회 2003년도 Proceedings of the Convention of the Pharmaceutical Society of Korea Vol.1
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pp.289.2-289.2
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2003
The aim of this work was to develop an reverse-phase method for the analysis lysozyme contents. This method was sensitive and reproducible. The experimental samples were 8 kinds of capsules and one tablet. collected in domestic area. The results were summarized as follows. (omitted)
여러 항산화물질이 어류의 비특이적 면역능을 증강시키는 것이 알려져 있다. 본 연구에서는 glutathione의 생합성 전구체인 항산화물질 N-acetylcysteine(NAC)이 8종의 어류에서 비특이적 면역지표를 증가시키는 지를 검토하였다. NAC를 10 mg/kg의 용량으로 메기, 미꾸라지, 잉어, 붕어, 뱀장어, 가물치, 틸라피아 및 숭어에 복강내로 투여하고, 48시간 후 두신백혈구 세포의 화학발광반응 및 혈청 lysozyme 활성을 측정하였다. 붕어와 미꾸라지를 제외한 6종의 어류에서 화학발광 반응이, 틸라피아를 제외한 모든 어류에서 lysozyme 활성이 각각 증가하였다. 이 결과는 NAC가 다양한 어종에서 비특이적 면역증을 증가시키며, 이 현상은 어류양식에서의 실용화도 고려해 볼 가치가 있음을 의미한다.
Cellulose분해력이 높은 Cellulomonas속 세균의 원형질체 융합을 위한 원형질체 형성조건을 조사하여 본 결과 같은 Cellulomonas 속인 Cellulomonas sp. C S 1- 1과 Cellulomonas flavigena NCIB 12901 균주일지라도 그 형성조건에 현저한 차이가 있어 CS1-l균주는 lysozyme농도 $100{\mu}g/ml$ 30분정도의 처리로 99.9%의 높은 원형질체 형성을 얻을 수 있는 반면 C.flavigena 균주는 lysozyme 농도도 훨씬 높고 장시간이 소요되어 $600{\mu}g/ml$. 6시간 정도의 처리에 약80%의 원형질체 형성을 보였다. 또한 세균 배양기간이 미치는 영향도 CS1-l균주는 별 영향을 받지 않고 원형질체화 되었으나 C. flavigena균주는 매우 민감하게 영향을 받아 대수증식기 중기의 세포가 말기의 세포보다 원형 질체가 잘 이루어 졌다. 원형질체 형성확인방법에서도 CS-1 균주는 osmotic shock을 주어 원형질체를 계수하거나 SEM으로 확인하거나 같은 결과를 얻었으나 C. flavigena 균주는 osmotic shock에 의한 원형질체의 계수결과와 SEM으로의 결과가 서로 달라 확인방법으로 두 방법이 병행되어져야 함을 보여주었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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