Insulin stimulates glucose uptake in muscle and adipose cells primarily by recruiting GLUT4 from an intracellular storage pool to the plasma membrane. Dysfunction of this process known as insulin resistance causes hyperglycemia, a hallmark of diabetes and obesity. Thus the understanding of the mechanisms underlying this process at the molecular level may give an insight into the prevention and treatment of these health problems. GLUT4 in rat adipocytes, for example, constantly recycles between the cells surface and an intracellular pool by endocytosis and exocytosis, each of which is regulated by an insulin-sensitive and GLUT4-selective sorting mechanism. Our working hypothesis has been that this sorting mechanism includes a specific interaction of a cytosolic protein with the GLUT4 cytoplasmic domain. Indeed, a synthetic peptide of the C-terminal cytoplasmic domain of GLUT4 induces an insulin-like GLUT4 recruitment when introduced in rat adipocytes. Relevance of these observations to a novel euglycemic drug design is discussed.
Park, Kunyou;Ju, Sungeun;Kim, Nari;Park, Seung-Yeol
BMB Reports
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제54권5호
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pp.246-252
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2021
The Golgi complex plays a central role in protein secretion by regulating cargo sorting and trafficking. As these processes are of functional importance to cell polarity, motility, growth, and division, there is considerable interest in achieving a comprehensive understanding of Golgi complex biology. However, the unique stack structure of this organelle has been a major hurdle to our understanding of how proteins are secreted through the Golgi apparatus. Herein, we summarize available relevant research to gain an understanding of protein secretion via the Golgi complex. This includes the molecular mechanisms of intra-Golgi trafficking and cargo export in the trans-Golgi network. Moreover, we review recent insights on signaling pathways regulated by the Golgi complex and their physiological significance.
KIF1B${\beta}$ is a member of the Kinesin superfamily proteins (KIFs), which are microtubule-dependent molecular motors that are involved in various intracellular organellar transport processes. KIF1B${\beta}$ is not restricted to neuronal systems, however, is widely expressed in other tissues, even though the function of KIF1B${\beta}$ is still unclear. To elucidate the KIF1B${\beta}$-binding proteins in non-neuronal cells, we used the yeast two-hybrid system, and found a specific interaction of KIF1B${\beta}$ and the sorting nexin (SNX) 17. The C-terminal region of SNX17 is required for the binding with KIF1B${\beta}$. SNX17 protein bound to the specific region of KIF1Bf3 (813-916. aa), but not to other kinesin family members. In addition, this specific interaction was also observed in the Glutathione S-transferase pull-down assay. An antibody to SNX17 specifically co-immunoprecipitated KIF1B${\beta}$ associated with SNX17 from mouse brain extracts. These results suggest that SNX17 might be involved in the KIF1B${\beta}$-mediated transport as a KIF1B${\beta}$ adaptor protein.
Oral squamous cell carcinoma (OSCC), which accounts for approximately 90% of oral cancers, has a high rate of local recurrence and a poor prognosis despite improvements in treatment. Exosomes released from OSCC cells promote cell proliferation and metastasis. Although it is clear that the biogenesis of exosomes is mediated by the endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) machinery, the gene expression pattern of ESCRT, depending on the cell type, remains elusive. The exosomal release from the human OSCC cell lines, HSC-3 and HSC-4, and their corresponding gefitinib-resistant sub-cell lines, HSC-3/GR and HSC-4/GR, was assessed by western blot and flow cytometry. The levels of ESCRT machinery proteins, including Hrs, Tsg101, and Alix, and whole-cell ubiquitination were evaluated by western blot. We observed that the basal level of exosomal release was higher in HSC-3/GR and HSC-4/GR cells than in HSC-3 and HSC-4 cells, respectively. Long-term gefitinib exposure of each cell line and its corresponding gefitinib-resistant sub-cell line differentially induced the expression of the ESCRT machinery. Furthermore, whole-cell ubiquitination and autophagic flux were shown to be increased in gefitinib-treated HSC-3 and HSC-4 cells. Our data indicate that the expression patterns of the ESCRT machinery genes are differentially regulated by the characteristics of cells, such as intracellular energy metabolism. Therefore, the expression patterns of the ESCRT machinery should be considered as a key factor to improve the treatment strategy for OSCC.
Many age-dependent neurodegenerative diseases are associated with the accumulation of abnormally folded proteins within neurons. One of the major proteolytic pathways in the cell is the autophagy pathway, which targets cytoplasmic contents and organelles to the lysosomes for bulk degradation under various physiological and stressful conditions. Although the importance of autophagy in cellular physiology is well appreciated, its precise roles in neurodegeneration remain largely unclear. Recent studies indicate that components of the endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) are important in the autophagy pathway. Reduced activity of some ESCRT subunits leads to the accumulation of autophagosomes and failure to clear intracellular protein aggregates. Interestingly, rare mutations in CHMP2B, an ESCRT-III subunit, are associated with frontotemporal dementia linked to chromosome 3 (FTD3). Mutant CHMP2B proteins seem to disrupt the fusion of autophagosomes and lysosomes in cell culture models. These findings suggest a potential mechanism for the pathogenesis of FTD3 and possibly other neurodegenerative diseases as well.
Yeast pheromone a-factor is a 13-amino acid peptide hormone that is synthesized as a part of a larger precursor, prepro-$\alpha$-factor, consisting of a signal peptide and a proregion of 64 amino acids. The carboxy-terminal half of the precursor contains four tandem copies of mature $\alpha$-factor. To investigate the molecular basis of intracellular sorting, proteolytic processing, and storage of the peptide hormone, yeast prepro-$\alpha$-factor precursors were heterologously expressed in rat pituitary $GH_3 cells. When cells harboring the precursor were metabolically labeled, a species of approximately 27 kD appeared inside the cells. Digestion with peptide: N-glycosidase F (PNG-F) shifted the molecular mass to a 19 kD, suggesting that the 27 kD protein was the glycosylated form as in yeast cells. The nascent polypeptide is efficiently targeted to the ER in the $GH_3 cells, where it undergoes cleavage of its signal peptide and core glycosylation to generate glycosylated pro-a-factor. To look at the post ER intracellular processing, the pulse-labelled cells were chased up to 2 hrs. The nascent propeptides disappeared from the cells at a half life of 30 min and only 10-25% of the newly synthesized, unprocessed precursors were stored intracellularly after the 2 h chase. However, about 20% of the pulse-labeled pro-$\alpha$-factor precursors were secreted into the medium in the pro-hormone form. With increasing chase time, the intracellular level of propeptide decreased, but the amount of secreted propeptide could not account for the disappearance of intracellular propeptide completely. This disappearance was insensitive to lysosomotropic agents, but was inhibited at $16^{circ}C or 20^{\circ}C$, suggesting that the turnover of the precursors was not occurring in the secretory pathway to trans Golgi network (TGN) or dependent on acidic compartments. From these results, it is concluded that a pan of these heterologous precursors may be processed at its paired dibasic sites by prohormone processing enzymes located in TGN/secretpry vesicles producing small peptides, and that the residual unprocessed precursors may be secreted into the medium rather than degraded intracellularly.
Mifepristone (MIF)와 Tamoxifen (TAM)은 각각 전립선암과 유방암치료제로 오랫동안 사용되고 있다. MIF는 안드로겐수용체(AR) 양성인 세포와 음성이 세포 모두에서 세포사멸을 유도하며, TAM 은, 리간드-수용체작용 기작의 다양한 특성에 의하여 에스트로겐(ER) 양성인 세포뿐 만 아니라 다른 종류의 암세포에서도 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 AR 음성인 DU-145 전립선암세포에 있어서, MIF와 TAM의 세포독성이 세포 내 칼슘농도 변화에 기인된 세포사멸기작에 의한 것임을 보여준다. MIF와 TAM을 처리시 세포성장은 농도와 시간의존적으로 감소하였으며, confocal laser scanning microscopy (CLSM)과 fluorescence-activated cell sorting (FASC)로 세포를 분석한 결과 각각 MIF와 TAM을 2일간 처리한 세포에서 세포사멸이 진행되는 것을 관찰하였다. 세포독성효과를 비교했을 경우, TAM이 MIF 보다 강하게 작용하였다. MIF와 TAM을 처리한 세포 내 칼슘변화 측정 시, 칼슘농도 또한 처리 약물의 농도와 시간 의존적으로 증가하였다. 1.5 mM 칼슘배지와 칼슘제거된 배지에서의 실험결과를 비교한 바, 세포 내 칼슘증가는 외부로부터의 유입에 의한 것으로 생각된다. 세포독성효과와 마찬가지로 칼슘증대 효과 역시 TAM에서 뚜렷하게 나타났다. 수용체 매개 세포사멸기작의 초기에 관여하는 procaspase-8은 MIF 처리 시 뚜렷이 활성화 되었으나, TAM의 경우 활성화가 MIF의 경우에 비해 강하지 못하였다. 그러나, 세포사멸의 중추적인 역할을 하는 caspase-3은 TAM 을 처리한 세포에 있어서 활성 정도가 훨씬 높았다. 세포사멸과정의 중요한 조절 단백질인 Bcl-2 그룹단백질의 발현을 조사해 본 결과, 세포사멸 억제단백질인 Bcl-2의 발현은 MIF, TAM 처리 시 동일하게 감소한 반면, 촉진단백질인 Bax의 발현은 2-3배 가량 증대되었다. 이상의 결과로 보아 MIF와 TAM은 세포 내 칼슘조절을 통하여 세포사멸을 유도하나, 세포사멸의 초기단계는 MIF와 TAM이 서로 다른 경로를 경유할 가능성이 있는 것으로 생각된다.
NHERF ($Na^+/H^+$ exchanger regulatory factor) and E3KARP (NHE3 kinase A regulatory protein) play important roles in membrane targeting, trafficking and sorting of ion channels, transmembrane receptors and signaling proteins in many tissues. Each of these proteins contains two PDZ (PSD-95/Dlg-1/ZO-1) domains, which mediate the assembly of transmembrane and cytosolic proteins into functional signal transduction complexes. The interaction between NHERF and E3KARP was investigated by surface plasmon resonance spectroscopy (BIAcore), fluorescence measurement, His-tagged pull-down experiment, and size-exclusion column (SEC) chromatography. BIAcore experiments revealed that NHERF bound to E3KARP with an apparent $K_D$ of 7 nM. Fluorescence emission spectra of the NHERF-E3KARP complex suggested that the tight interaction between these proteins was accompanied by significant conformational changes in one or both. The CD spectra of NHERF and E3KARP show that the conformational changes of these proteins were dependent on pH and temperature. These results implicate that the NHERF-E3KARP complex allows intracellular signaling complexes to form through PDZ-PDZ interactions.
Endosomes lower their internal pH by an ATP-driven proton pump, which is critical to dissociation of many receptor-ligand complexes, the first step in the intracellular sorting of internalized receptors and ligands. Endosomes are known to exhibit n great range of pH values that can vary between 5.0 and 7.0 within a single cell although the factors that regulate endosomal pH remain uncertain. To evaluate the morphological and topological differences of endosomes in the different stages, confocal microscopy was used. The early endosomes labeled with fluorescein isothiocyanate-dextran for 10 min at $37^{\circ}C$ were identifiable at the peripheral and tubule-vesicular endosome compartment. In contrast, the late endosomes formed by 10 min pulse and 20 min trace were located deeper in the cytoplasm and showed more vesicular features than early endosomes. For the purpose of determining whether ATP-dependent acidification was heterogeneous and whether the differences in acidification were attributed to differences in the activity of $Na^{+}-K^{+}$-ATPase and/or $Cl^{-}$ channel, endocytic compartments were fractionated into subpopulation using percoll gradient and measured ATP-dependent acidification. While all fractions exhibited ATP-dependent acidification activity, both the initial rate of acidification and extent of proton translocation were lower in early endosomes and gradually increased in late endosomes. Phosphorylation by PKA and ATP enhanced ATP-dependent acidification in both early and late endosomes, hut there was no difference in the degree of enhancement by phosphorylation between two subpopulations. When ATP-dependent acidification was determined in the presence or absence of vanadate ($Na_{3}VO_{4}$) or ouabain, only early endosomes exhibited the vanadate or ouabain dependent stimulation of acidification activity, suggesting the inhibition of $Na^{+}-K^{+}$-ATPase. Therefore, it seems probable that the inhibition of early endosome acidification by $Na^{+}-K^{+}$-ATPase observed in vitro at least in part plays a physiological role in controlling the acidification of early endosomes in vivo.
Resistance training (RT) is associated with reduced risk of low grade inflammation related diseases, such as cardiovascular disease and type 2 diabetes. The majority of the data studying cytokines and exercise comes from endurance exercise. In contrast, evidence establishing a relationship between RT and inflammation is more limited. This review focuses on the cytokine responses both following an acute bout, and after chronic RT. In addition, the effect of RT on low grade systemic inflammation such as individuals at risk for type 2 diabetes is reviewed. Cytokines are secreted proteins that influence the survival, proliferation, and differentiation of immune cells and other organ systems. Cytokines function as intracellular signals and almost all cells in the body either secrete them or have cytokine receptors. Thus, understanding cytokine role in a specific physiological situation such as a bout of RT can be exceedingly complex. The overall effect of long term RT appears to ameliorate inflammation, but the specific effects on the inflammatory cytokine, tumor necrosis factor alpha are not clear, requiring further research. Furthermore, it is critical to differentiate between chronically and acute Interleukin-6 levels and its sources. The intensity of the RT and the characteristics of the training protocol may exert singular cytokine responses and as a result different adaptations to exercise. More research is needed in the area of RT in healthy populations, specifically sorting out gender and age RT acute responses. More importantly, studies are needed in obese individuals who are at high risk of developing low grade systemic inflammatory related diseases. Assuring adherence to the RT program is essential to get the benefits after overcoming the first acute RT responses. Hence RT could be an effective way to prevent, and delay low grade systemic inflammatory related diseases.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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