• 한국가축번식학회지
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• 제23권4호
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• pp.293-301
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• 1999

본 실험은 체외 생산된 한우 배반포기배가 초자화 동결과 1- 단계 융해 후 체외 / 체내에서 성공적으로 생존할 수 있는지의 여부를 확인하고자 실시하였다. 초자화 동결은 glycerol (G) 또는 / 과 ethylene glycol(EG), 그리고 10% FBS가 들어있는 D- PBS 동결액을 이용하여 배반포기배를 10% G 에서 5분, l0%G와 20% EG 혼합액에서 5분 그리고 2S%G와 2S% EG 혼합액에서 30 초간 노출시켰으며, straw에 넣은 후 질소 증기에 3분간 쐬고 액화질소에 침지함으로써 완성하였다. 1-단계 융해는 straw 자체를 $25^{\circ}C$와 36$^{\circ}C$에 각각 5분과 3분간 처리함으로써 이루어졌으며, 융해 후 회수된 난자는 단층배양이 유도된 난구세포 소적에서 48시간 배양하거나 대리모인 소에 이식하였다. 체외 생존능 평가를 융해 후 24시간째의 재팽창율과 48시간째의 부화율로 조사하였을 때, 대조군의 정상 발달 (100.0, 63.3%)보다는 유의하게 낮았지만 초자화 동결군의 결과 (85.4, 43.8%)는 높게 나타났다 (P＜0.001, P＜0.05). 발달단계에 따른 체외생존능을 조사하였을 때, 빠르게 발달된 배반포기배가 느리게 발달하는 난자군보다 유의하게 높은 생존율을 나타내었다 (부화초기 : 88.0, 48.0%; 팽윤 : 81.1, 45.3%; 초기 : 66.7, 14.3%) (P＜0.05). 또한, 배반포기배가 생산된 나이(체외수정 후 7, 8, 9 일) 에 따른 초자화동결군의 체외생존능을 조사하였을 때, 배의 나이가 어릴수록 체외생존능은 유의하게 높은 경향을 나타내었다 (7 일 : 67.3, 34.5%; 8 일 : 76.9, 40.7%; 9 일 : 60.9, 23.9%) (P＜0.05). 초자화동결된 한우배반포기배의 1-단계 융해 후 체내생존 가능성을 확인하고자 8마리의 소에 이식하였을 때, 4마리가 임신된 것을 확인하였다. 따라서, 이상의 높은 생존율을 고려하여 볼 때, 본 연구에서 사용된 초자화동결과 1-단계 융해는 기존의 동결란을 융해 이식할 때 필요로 했던 실험장비나 고도의 숙련된 기술 없이도 실험현장에서 쉽게 이용할 수 있으면서 효율적인 결과를 얻을 수 있는 방법이라는 것을 알 수 있었다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제23권1호
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• pp.1-6
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• 1996

There are a number of problems during the process of culture in vitro on fertilization and embryo development compared to those on in vivo counterparts. And the platelet activating factor (PAF), which is found not only in mammalian spermatozoa but also preembryos, is implicated on reproductive process. To improve the environment of culture on in vitro fertilization and embryo development, coculture using salpingeal epithelial cells has been considered to accept the better result on pregnancy rate. This study was designed to determine if two different culture systems, coculture alone and PAF treated coculture, are positive or negative influence on process of in vitro fertilization and embryo culture in mouse. The cell cleavage rate reached to 2-4 cell stage at 24 hours of culture is 56.81% (50/88) and 48.21%(54/112) respectively, in PAF treated group which is added PAF on coculture and in coculture group. But the rate of cells cleavage was similar in both group after 48 hours of culture. The rate of unfertilization after insemination of oocytes was higher in coculture group(55..53%) than in PAF treated group(42.37%). And in assessment of undeveped embryos, the rate of equalized cell block was similar on both, coculture alone (35.3%)and PAF treated coculture(35.5%). while unequalized cell block was higher rate in PAF treated coculture(19.4%) than coculture alone (11.8%). But the rate of cytoplasmic degeneration of undeveloped embryos was significantly higher in PAF treated coculture than coculture alone. In conclusion, we have observed that PAF treated coculture is superior in the rates of in vitro fertilization and early embryo cell cleavage compared to those in coculture alone, but there is no difference on the rates of embryo develpments, cell degeneration, cell quality in both PAF treated coculture and coculture alone when the embryo cells were continuosly cultured for 48 hours or more.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제35권3호
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• pp.281-285
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• 2011

In the present study, we identified differentially methylated region (DMR) upstream of Dnmt1o and Dnmt1s gene in early porcine embryos. Porcine Dnmt1o had at least one DMR which was located between -530 bp to -30 bp upstream from transcription start site of the Dnmt1o gene. DNA methylation analyses of Dnmt1o revealed the DMR to be hypomethylated in oocytes, whereas it was highly methylated in sperm. Moreover, the DMR upstream of Dnmt1o was gradually hypermethylated from oocytes to two cells and dramatically changed in the methylation pattern from four cells to BL stages in an in vivo. In an IVF, the methylation status in the DMR upstream of Dnmt1o was hypermethylated from one cell to eight cells, but demethylated at the Morula and BL stages, indicating that the DNA methylation pattern in the Dnmt1o upstream ultimately changed from stage to stage before the implantation. Next, to elucidate whether DNA methylation status of Dnmt1s upstream is stage-by-stage changed in during porcine early development, we analyzed the dynamics of the DNA methylation status of the Dnmt1s locus in germ cell, or one cell to BL cells. The Dnmt1s upstream was highly methylated in one and eight cells, while less methylated in two, four, morula, and BL cells. Taken together, our data demonstrated that DNA methylation and demethylation events in upstream of Dnmt1o/Dnmt1s during early porcine embryos dramatically occurred, and this change may contribute to the maintenance of genomewide DNA methylation in early embryonic development.

• 한국수정란이식학회지
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• 제23권2호
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• pp.101-108
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• 2008

This study investigated the developmental ability and gene expression of somatic cell nuclear transfer embryos using ear skin fibroblast cells derived from miniature pig. When miniature pig (m) and landrace pig (p) were used as donor cells, there were no differences in cleavage (79.2 vs. 78.2%) and blastocyst rates (27.4 vs. 29.7%). However, mNT blastocysts showed significantly higher apoptosis rate than that of pNT blastocysts (6.1 vs. 1.7%) (p<0.05). The number of nuclei in pNT blastosysts was significantly higher than that of mNT (35.8 vs. 29.3) (p<0.05). Blastocysts were analyzed using Realtime RT-PCR to determine the expression of Bax-${\alpha}$, Bcl-xl, H19, IGF2, IGF2r and Xist. Bax-${\alpha}$ was higher in mNT blastocyst than pNT blastocyst (p<0.05). There was no difference in Bcl-xl between two NT groups. Bax-${\alpha}$/Bcl-xl was, however, significantly higher in mNT blastocyst compared to pNT. The expression of imprinting genes were aberrant in blastocysts derived from NT compared to in vivo blastocysts. H19 and IGF2r were significantly lower in mNT blastocysts (p<0.05). The expression of IGF2 and Xist was similar in two NT groups. However, imprinting genes were expressed aberrantly in mNT compared to pNT blastocysts. The present results suggest that the NT between donor cells derived from miniature pig and recipient oocytes derived from crossbred pig might affect reprogramming of donor cell, resulting in high apoptosis and aberrant expression patterns of imprinting genes.

• 한국가축번식학회지
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• 제25권1호
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• pp.9-17
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• 2001

본 연구는 수정란이식기법에 의해 우량 한우 송아지를 대량 생산할 수 있는 기반조성을 위한 한우 수정란이식 최적모델을 개발하기 위해 실시되었다. 본 시험에 공시된 수정란은 우량한 한우의 체내수정란 및 체외수정란을 생산하여 좋은 배반포 수정란을 신선 혹은 동결란 상태로 이식에 공시하였다. 수란우는 정상 발정주기를 가진 경산우로 CIDR을 이용하여 발정을 동기화 하였고 이식시 직장검사로 황체의 크기를 검사하고 초음파진단기로 황체의 구조를 조사하여 정상인 개체에 수정란을 이식하였다. 수란우의 최적 선정조건을 구명하고자 혈중 호르몬 및 대사물질을 분석하였으며 얻어진 결과는 다음과 같다. 1. 총 397두의 수란우에 수정란을 이식하여 121두가 임신하여 평균 30.5%의 수태율을 얻었다. 2. 수란우의 황체의 크기 및 황체내 강 형성 유무와 수태율간에는 차이가 없었으나 혈중progesterone 수준을 분석해 본 결과, progesterone 수준이 2.0ng/$m\ell$ 이상일 경우 수태율이 46.6%로 높게 나타났다. 3. 수란우의 혈중 Total cholesterol은 90~110mg/dl, BUN은 14~16mg/dl, Glucose 수준은 70~80mg/dl에서 가장 높은 수태율을 나타내어 이들 혈중 대사물질이 수태율에 영향을 미치는 것으로 나타났다.

• 대한의생명과학회지
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• 제10권4호
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• pp.391-395
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• 2004

The demand for the production of gene-defective mice from embryonic stem (ES) cells is increasing to clarify decisive gene function in vivo. Although blastocyst injection is widely used to generate ES cell-mediated knockout mice, coculture method has been alternatively used because of several advantages, such as low cost and simple procedure. Thus, this experiment was designed to demonstrate the feasibility of the coculture method using J1 ES cells, which are known to be efficient for blastocyst injection. Eight-cell embryos were harvested from 2.5 days post-coitum (dpc), denuded with acid tyrode's solution, and transferred onto trypsinized J1 ES cells. Aggregation was carried out following two typical methods, which are simple coculture method and aggregation in groove prepared by aggregation needle. Successfully aggregated-embryos were developed to blastocysts for 24 h and transferred into uterus of pseudo-pregnant foster mother. Chimeric offspring was judged by coat pigmentation. In this study, we could obtain chimeric mice from all the two aggregation methods, but the chimera production efficiencies in coculture using groove were three times higher at least than those in the other group. In conclusion, these observations suggest that coculture method should be available for production of knockout mice from J1 ES cells. Presently, the germ-line transmission rates of the chimeras produced from the two methods are under investigation.

• Environmental Analysis Health and Toxicology
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• 제6권1_2호
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• pp.71-82
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• 1991

포유동물의 최기형성을 연구하는데 가장 많이 사용되는 동물인 설치류중 랫트의 배자를 이용하여, egg-cylinder기를 지나 head-fold가 이루어지는 초기체절기인 9.5일경부터 뇌, 눈, 귀, 심혈관계가 형성되는 시기인 11,5일까지 2일(48시간) 동안, 체외에서 배양하였다. 그 배양의 최적조건은 실험실마다 다르기 때문에 최적조건확립을 목적으로 이 실험을 행하였다. 온도는 37$^{\circ}C$$\pm$0.2$^{\circ}C$로 유지시키고 가스는 배양초기인 9.5일~10.5일 동안을 50%$O_2$, 5% $CO_2$, 90% $N_2$가스를 공급하여 10.5일부터 6시간 동안은 20% $O_2$, 5% $CO_2$, 75% $N_2$로 하며 나머지 18시간 동안은 40% $O_2$, 5% $CO_2$, 55% $N_2$가스를 배양계에 공급했을 때 가장 좋은 결과가 나왔다. 배양배지로서는 랫트 IC 혈청을 분리하여 열비동화시켜서 사용하였다. 이종혈청이나 합성배지를 첨가해서 배양할 경우는 랫트 혈청에 비해 성장이 좋지 않은 것으로 관찰되었다. 동물실험법의 대체법으로서 배자배양법의 기본조건을 확립하여 최기형성 평가 방법으로서의 가능성을 제시하였다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제28권3호
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• pp.181-185
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• 2004

본 연구는 동물복제 및 형질전환 동물생산 등의 연구에 기초자료를 제공하고자 재래산양의 oocyte를 단위발생을 유도하여 회수난자의 조건, 활성화방법, 배양조건 등이 단위발생란의 체외발달율에 미치는 영향을 조사하여 재래산 양의 최적의 배양조건을 확립하고자 실시하였다. 난자의 회수는 체중 15～25 Kg 전 ㆍ 후의 성숙한 미경산 재래산양에 FSH와 PMSG 를 사용하여 과배란을 유기하여 hCG 투여 후 제 35시간째에 외과적인 방법으로 in vivo (체내성숙) 난자는 난관을 관류하는 방법으로 회수하였고, in vitro (체외성숙) 난자는 난포로부터 흡입하여 난포란을 채취하여 약 22시간 체외성숙을 실시하였다. 활성화 처리는 전기자극법과 Ionomycin + 6-DMAP를 처리하여 단위발생을 유도하였다. 복제수정란의 배양은 M16, TCM-199 및 mSOF 배양액으로 6～7일 동안 체외배양을 실시하였다. 활성화를 유도하기 위하여 전기자극 및 ionomycin + 6-DMAP 처리를 하였을 때 분할율은 각각 64.1 및 76.5%로서 이들간에 차이는 없었다. 배반포기로의 발달율은 전기자극방법으로는 전혀 발달이 이루어지지 않았으나, ionomycin +6-DMAP 처리방법에서는 15.6%가 배반포로 발달하였다. In vivo 난자와 in vitro 난자를 활성화를 유도하였을 때 분할율은 86.8 및 69.0%로서 이들간에 유의적인 차이는 없었다. 4-세포기(93.9% vs 66.1%), 8-세포기(90.9% vs 37.0%) 및 상실배기(89.4% vs 23.6%)는 이들간에 유의적(P<0.05)인 차이가 있었으며, 배반포기로의 발달율은 체내성숙난자가 50.0%로서 체외성숙난자의 0.8%보다는 유의적으로 높았다. 활성화를 유도한 난자를 mSOF 배양액으로 체외배양을 실시하였을 때 분할율은 81.0%로서 TCM-199 +oviduct cell 의 64.3% 및 Ml6 배양액의 51.6%보다는 높게 나타났다. 배반포기로의 발달율은 mSOF 배양액에서는 3.4%가 발달하였으나, TCM-199+ oviduct cell 배양액과 M16 배양액에서는 전혀 발달이 이루어지지 않았다. 이상의 결과는 포유동물 난자의 단위발생의 유도 및 체외배양시 난자의 공급원, 난자의 활성화 방법 및 배양조건 등이 차후 단위발생란의 체외발생율에 크게 영향을 미칠 수 있는 근거를 제시해 준다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제34권3호
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• pp.201-205
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• 2010

The objective of this study was investigate the superovulation treatment and to relate concentrations of blood urea nitrogen(BUN) in Hanwoo donors. Thirty six, at random stages of the estrous cycle, received a CIDR. Four days later, the animals were superovulated with a total of 28AU FSH (Antorin, 2AU=1 ml) administered twice daily in constant doses over 4 days. On the 3th administration of FSH, CIDR was withdrawn and 25 mg $PGF_2a$ was administered. Cows were artificially inseminated twice after estrous detection at 12 hr intervals. The cows received $100\;{\mu}g$ GnRH at the time of 1st insemination. Embryos were recovered 7 or 8 days after the 1st insemination. Cows with BUN <10, 11~18 and ${\geq}$19 mg/dl had return of estrus of 34.6, 30.5 and 30.4 days respectively. Return of estrus after superovulation treatment was not significantly lower for cows with blood urea nitrogen (BUN) above 10 mg/dl than for cows with BUN below 10 mg/dl. Cows with BUN <10, 11~18 and ${\geq}$19 mg/dl had number of transferable embryos of $3.2{\pm}1.2$, $5.4{\pm}1.9$ and $4.1{\pm}2.1$ respectively.

• 한국가금학회지
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• 제35권3호
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• pp.241-245
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• 2008

형질 전환 닭 생산 방법들 가운데 목적 유전자 운반에 탁월한 능력이 있는 것으로 알려진 렌티바이러스는 배반엽 단계 수정란을 이용한 형질 전환 닭 생산 연구에 활발하게 이용되고 있다. 본 연구는 재조합 렌티바이러스를 이용하여 사람의 SOD-3 단백질이 닭의 ovalbumin 프로모터에 의해서 유도되는 형질 전환 닭을 생산하고자 하였다. 사람의 SOD-3 단백질은 호흡 과정에서 체내에서 생성되는 활성산소를 중화시키는 탁월한 기능이 있는 것으로 알려져 있다. 후보 병아리의 생산은 앞서 언급한 유전자를 가지는 $1{\times}10^6$ cfu/mL 재조합 렌티바이러스를 배반엽 단계 수정란의 미세 주입하고 대리난각 배양법을 이용하여 배양기에서 21일 동안 배양하는 방법으로 생산하였다. 유전자를 미세주입한 341개의 수정란에서 78수의 후보 형질 전환 병아리를 생산하였으며, 생산된 후보 형질 전환 병아리들의 유전 분석은 PCR 방법을 이용하여 검증하였다. 유전 분석 결과는 성 성숙에 이른 47수의 수컷들 가운데 2수의 정액에서 사람의 SOD-3 유전자가 존재함을 보였다. 이상의 연구 결과는 완전한 형태의 형질전환 닭 생산의 가능성을 보여주고 있다.