• 한국수정란이식학회지
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• 제24권1호
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• pp.39-45
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• 2009

This study was carried out to evaluate the nuclear, cytoplasmic maturation and developmental potential of bovine oocytes selected by brilliant cresyl blue (BCB) as indirect measurement of oocytes growth phase. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected from 2 to 8 mm follicles from slaughterhouse Hanwoo ovaries. The COCs were divided into stained cytoplasm to blue (BCB+) and unstained (BCB-) according to their ooplasm BCB coloration stained by $26{\mu}m$ of BCB after 90 min. Selected COCs were cultured in a TCM 199 for 18 to 26 h. Nuclear maturation and total cell number was evaluated after in vitro maturation (IVM) or in vitro culture (IVC) using $10{\mu}g/ml$ Hoechst 33342, and cytoplasmic maturation was evaluated by intracellular glutathione (GSH) assay before (0 h) and after (24 h) IVM. The oocyte diameters were not differed significantly between BCB+ ($157.4{\pm}5.8{\mu}m$) and BCB+ ($149.0{\pm}31.0{\mu}m$) groups (p>0.05). However, the proportion of metaphase II oocytes in BCB+ group was significantly higher than BCB- group after IVM (p<0.05). GSH content of BCB+ group oocytes was significantly higher than that of BCB- group just after collection ($7.3{\pm}0.6$ vs. $4.8{\pm}0.6\;pmol/oocyte$, p<0.05), but not varied after IVM($13.1{\pm}0.9$ and $12.6{\pm}2.5\;pmol/oocytes$ for BCB+ and BCB- respectively; p>0.05). The proportion of blastocyst formation and total cell number in BCB+ group (23.5% and $105.5{\pm}28.6$) was significantly higher than that in BCB- (9.8% and $72.4{\pm}26.1$; p<0.05). The results indicate that BCB+ group oocytes may provide a cellular and functional basis for the greater developmental competence in Korean Native Cow (KNC) oocytes.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권1호
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• pp.27-34
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• 1996

본 연구는 immunosurgery와 polynucleotide-specific 형광물질을 이용한 differential labelling기법으로 체외에서 소 수정란의 배발달을 유기하는데 효과적인 것으로 알려진 CR1배양액을 사용하여 체외생산된 소 배반포기배의 inner cell mass (ICM)와 trophectoderm(TE)의 총 세포수를 조사하고자 실시하였다. 공시 배반포기배는 체외수정 후 8일째에 얻어졌다. 체외생산된 배반포기배는 배반포강의 확대와 투명대 두께의 감소를 기준으로 초기, 중기 및 팽윤단계로 구분하였으며, 또한 같은 배발달군내의 배반포기배는 다시 두 군으로 나누어 bisbenzimide만을 처리하여 얻어진 총세포수와 immunosurgery와 two polynulceotide-specific 형광물질을 이용하여 얻어진 ICM와 TE의 총세포수를 비교하여 얻어진 결과는 다음과 같다. 1) 체외수정 후 8일째 배반포기배의 발달율은 29.3%였으며, 초기, 중기, 팽윤 및 부화단계로 구분하였을 때의 발달율은 각각 8.7, 9.9, 7.6, 3.1%였다. 2) Bisbenzimide를 이용한 배반포기배의 총 세포수는 초기, 중기 및 팽윤단게가 각각 46.9$\pm$8.6, 66.2$\pm$12.5, 122.8$\pm$14.4를 나타냈다. 이러한 결과는 CR1이 소 수정란의 발달에 적절한 배양액임을 알 수 있었다. 3) Immunosurgery와 polynucleotide-specific 형광물질을 이용한 differential labelling기법으로 배반포기배의 ICM과 TE 세포수를 초기, 중기 및 팽윤단계로 나누어 조사한 결과, ICM 세포수는 각각 12.8$\pm$5.9, 26.3$\pm$8.4, 35.5$\pm$15.0개 이었고, TE 세포수는 각각 30.5$\pm$5.0, 41.3$\pm$8.2, 81.1$\pm$13.4개로 나타나 ICM과 TE 세포수는 초기 배반포기배에서 팽윤 배반포기배로 진행됨에 따라 두배에서 세배 정도 증가되었음을 알 수 있었다. 또한, differential labelling과 bisbenzimide기법에서 얻어진 각각의 총세포수를 비교하였을 때 총세포수는 발달의 진행 정도에 따라 증가되며 그와 동시에 동일한 군 간의 세포수도 거의 유사함을 알 수 있었다. 따라서, ICM과 TE를 differential labelling하는 기법은 수정란의 quality를 평가하는데 매우 유용한 기법으로서 착상전 embryo 발달을 연구하는데 효과적으로 이용될 수 있다는 것을 시사한다.

• 한국약용작물학회지
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• 제3권2호
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• pp.100-106
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• 1995

현탁배양으로 체세포배를 대량 생산하는데 관여하는 요인 들을 조사분석하고. 생산된 체세포배를 encapsulation시켜 인공종자화가 가능한지를 검토한 결과를 요약하면 아래와 같다. 1. 현탁배양에서 LS(Linsmeier-Skoog) 배지가 어뢰형과 자엽기의 체세포배 형성율이 높았다. 2. 현탁배양시 체세포배 형성에 영향하는 탄소원은 sucrose가 가장 효과적이었다. Gtucose에서도 자엽 기의 체세포배가 형성되었으나 sucrose에서보다는 적었다. Fructose, lactose 및 maltose는 효과가 없었다. 3. 현탁 LS 배지에서 sucrose 농도는 3%가 체세포배 형성에 적합한 농도로 나타났다. 4. 현탁 LS 배지에서 질소원을 달리하여 체세포배 형성율을 조사한 결과 암모니아태 질소의 영향은 거의 없는 것으로 나타났다. 또한 암모니아태 질소와 질산태 질소의 비율을 $413(mg/{\ell})\;:\;1900(mg/{\ell})$로 하는 것이 바람직하다고 판단되었다. 5. 현탁배양에서 계대배양 3회까지는 체세포배형성에 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나 불필요하게 계대배양 회수를 증가시킬 필요는 없다고 본다. 6. 고형배지에서 체세포배 형성을과 형성 수에는 BA단독보다는 NAA를 혼용하는 것이 효과적이었으며 이 효과는 BA 농도가 높은 경우에 크게 나타났다. 7. 고형배지에서 체세포배 형성율과 형성 수에는 kinetin 단독보다는 NAA와 혼용하는 것이 바람직하며 이 효과는 kinetin의 농도가 높은 경우가 좋았다. 8. 고형배지에서 체세포배 형성율과 형성 수에는polyamines 중에서 spermidine과 spermine이 효과적이었으며 spermine $10mg/{\ell}$처리에서 가장 많은 체세포배가 형성되었다. 9. 기내묘에서 발생하는 vitrification을 억제시키기 위하여 질산은을 처리하더라도 체세포배 형성이나 형성율에 별다른 영향이 없었다. 10. 체세포배를 encapsulation 할 때 인공종자의 구형 형성은 sodium alginate 농도를 3%로 인한 경우 가장 좋았으나 인공종자의 발아율은 2.5%에서 100% 발아가 되었고 3%에서는 88%가 발아하였다. 11. 인공종자는 발아하여 정상적으로 생장하면서 shoot와 root를 형성하였다.

• 한국정보통신학회:학술대회논문집
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• 한국정보통신학회 2018년도 추계학술대회
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• pp.448-451
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• 2018

본 연구는 뉴런 세포와 슈반 세포의 공동 배양에 의한 수초화 발생 과정과 herpes simplex virus-1 감염에 의한 탈수초화 발생과정을 전자 현미경과 분자생물학적 분석에 의하여 확인하고자 하였다. 쥐의 배아로부터 후근신경절(dorsal root ganglion, DRG)을 분리하여 슈반(Schwann) 세포와 뉴런 세포(neuronal cell)를 in vitro에서 각각 배양하였다. 유사 분열 억제인자로 처리한 뉴런세포와 정제된 슈반세포를 함께 공동 배양을 하여 수초화를 발생시켰다. 이렇게 수초화된 공동 배양 세포에 herpes simplex virus-1를 감염시켜 탈수초화를 진행시켰다. 수초 형성의 존재를 의미하는 myelin protein zero(MPZ) 항체를 사용하고 전자 현미경을 이용하여 수초 발생 및 탈수초화 과정을 관찰하였다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제17권1호
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• pp.61-65
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• 2002

한우 미성숙 난자의 vitrification 동결시 발생단계별 생존성과 체외발생율을 알아보고자 난자를 0, 10, 14 및 20시간 성숙배양시킨 후 vitrification 동결 융해 후의 체외발생율을 조사하였다 본 연구에서 나타난 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 0, 10, 14 및 20시간 성숙배양시킨 난자를 vitrification 동결보존 후 MR 단계로의 발생율은 각각 33.3%, 55.0%, 68.3% 73.3%였으며, diploid로의 발생율은 26.7%, 21.7%, 6.7%, 1.7%로서 대조군의 M II 단계의 78.2%에 비해 낮게 나타났으나 diploid단계의 3.6%에 비해서는 높게 나타났다. 2. 미성숙 난자를 0, 10, 14 및 20시간 성숙배양 시킨 후 vitrification 동결 응해 후의 생존율은 각각 38.0%, 30.0%, 20.0% 및 12.0%로서 비동결 대조군의 48.0%에 비해 낮은 생존율을 나타냈다. 3. 미성숙 난자를 0, 10, 14 및 20시간 성숙배양 시킨 다음 vitrification동결 응해 후 수정하였 때 체외수정율은 64.6%, 61.6%, 54.8%, 32.3% 였으며, 배 반포로의 체 외 발생 율은 각각 32.3%, 21.7%, 14.5%, 4.6%로서 대조춘의 80.0%와 55.0%에 비해 낮은 체외수정율과 체외발생율을 나타냈다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제20권2호
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• pp.123-128
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• 2005

본 연구는 돼지 난포란의 vitrification 동결 시 내동제의 종류 및 농도가 생존율에 미치는 영향과 수정 후 체외발생율을 조사하고자 수행하였다. 1.0, 15, 30 및 40시간 성숙 배양시킨 난포란을 vitirfication 동결보존 후의 MII로의 발생율은 각각 $56.7\%,\;53.3\%,\; 63.3\%,\;65.0\%$였으며, diploid로의 발생율은 $23.3\%,\;18.3\%,\;10.0\%,\;3.3\%$로서 대조군의 ME 단계의 $78.2\%$에 비해 낮게 나타났으며 diploid 단계의 $5.5\%$에 비해서는 높은 체외성숙율을 나타냈다. 체외발생율은 초기의 미숙 난포란일수록 높은 체외성숙율을 나타냈다. 2. 미성숙 난포란을 회수 후 0, 15, 30 및 40시간 성숙 배양시킨 난포란을 vitirfication 동결 후 융해하였을 때 생존율은 각각 $34.0\%,\;26.0\%,\;18.0\%,\; 12.0\%,\;10.0\%$로서 비동결 난포란의 $60.0\%$에 비해 낮게 나타났지만 비교적 양호한 생존율을 나타냈다. 3. 0, 15, 30 및 40시간 성숙 배양시킨 미성숙 난포란을 vitrification 동결 융해 후 수정시켰을 때 체외수정율은 $60.0\%,\;54.0\%,\; 48.0\%,\;38.0\%$였으며, 배반포로의 체외발생율은 각각 $26.0\%,\;18.0\%,\; 8.0\%,\;4.0\%$로서 비동결 대조군의 $78.0\%$와 $38.0\%$에 비해 낮은 체외수정율과 체외발생율을 나타냈다. 4. 돼지 난포란을 EDS와 ETS 액으로 vitrifiestion 동결운해 후 $0\~15$ 시간 배양한 다음 체외수정시켰을 때 체외 수정율과 발생율은 각각 $50.0\%,\;22.0\%$ 및 $46.0\%,\;18.0\%$로서 대조군의 $74.0\%$와 $38.0\%$에 비해 낮게 나타났다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제19권1호
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• pp.35-42
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• 2004

본 연구는 돼지 배아의 유리화 동결 시 CB 처리군과 CB 비처리군의 영향을 비교하였다. CB의 농도별, 처리 시간별로 처리한 뒤 유리화 동결 융해 후 정상적인 형태 회수율과 생존률을 각각 조사하였다. 1. CB를 전 처리한 군과 비처리군의 정상적인 형태율이 각각 84.2%, 81.9%로 유의한 차이가 없었으나, 융해 후 72시간 째 생존률의 결과에서는 각각 60.5%, 32.8%로 유의성(p<0.1)이 검증되었다. 2. CB 농도별 생존률에 미치는 영향은 7.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$의 처리군이 다른 처리군에 비하여 유의적으로 높았다(p<0.05). 정상 형태율 95%와 융해 후 생존률 73%로서 다른 농도에 비하여 65∼76%, 15∼57%보다 각각 높았다. 3. 7.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ 농도의 CB 전처리의 처리 시간에 따른 영향은 20분 처리하였을 때 정상적인 형태율은 81%로 다른 처리군(25∼69%)보다 높았고, 24시간 째 생존률의 결과로도 64%, 6∼56%로 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 또한 원심 처리군과 비처리군에서도 CB를 20분으로 처리하였을 때 가장 좋은 결과를 나타내었으며, 원심 비처리군보다는 원심 처리군이 좀 더 높은 결과를 보여 주었다.

• 대한수의학회지
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• 제29권3호
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• pp.343-359
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• 1989

To study the effects of ibaraki virus on preimplantation mouse embryos collected from prepubertal ICR and BALB/cByJ mice (30~40days old) by superovulation, zona pellucidaintact(ZPI) or free(ZPF) embryos(n=774) of 4- to 8-cell and morulae were exposed to $10^{5.8}$ $TCID_{50}$ of the virus up to 96 hours. The embryos were examined morphologically by observing the degeneration and hatching rates, and virologically and immunologically by determining the presence of infection with the virus, in addition, the effect of washing the embryos to remove virus possibly attached to was also investigated. The ZPI 4- to 8-cell embryos and morulae exposed to the virus showed considerably higher degeneration rate than those not exposed, for 96, and for 72 to 96 hours, respectively(p<0.01). The ZPF 4- to 8-cell embryos and morulae exposed to the virus showed considerably higher degeneration rates than those not exposed, throughout the whole culture hours in vitro (p<0.01). The ZPI 4- to 8-cell embryos and morulae not exposed to the virus showed considerably higher rates of hatched blastocyst than those exposed (p<0.01). The virus infection rates of the ZPF 4- to 8-cell embryos and morulae were significantly higher than those of the ZPI embryos according to cell culture system. The viral antigen was detected exclusively on the zona pellucida of ZPI embryos, while the antigen was evenly distributed in the blastomeres of ZPF embryos by the immunofluorescent assay. In the ZPI embryos exposed to ibaraki virus, the virus was detected in the two times-washing groups, but not in the ten times-washing groups. The results indicated that zona pellucida of murine embryos would provide an effective protection and that ten times-washing of the ZPI embryos previously exposed to the virus was effective to remove virus from the embryos.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제35권1호
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• pp.47-53
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• 2008

겨우살이의 캘러스 형성 및 종자 발아 와 haustorium 발달에 요구되는 환경요인 및 생장조절제의 영향을 조사하였다. 아울러 종자의 인위부착을 통한 식물체 재생 체계를 확립하였다. 겨우살이 조직관찰 결과 종자에는 1개 또는 2개의 막대모양의 접합자배가 존재하며 종자의 외부에 위치한 유근 부위에 주로 세포분열이 왕성한 세포층이 존재하며 반대로 자엽은 종자 내부에 위치하며 상대적으로 분열능을 가진 세포수가 감소하였다. 겨우살이 종자 발아 와 haustorium 발달에 요구되는 여러 요인 중에서 광의 요구도가 절대적이었다. 본 실험에 조사된 다른 배양 환경요인 및 생장조절제들은 광의 효과를 대체하지 못하였으며 ethylene의 경우 발아촉진 효과가 3배 이상 증가함을 알 수 있었다. 여러 조직 중에서 오로지 겨우살이 화아로부터 캘러스 형성이 가능하였으며 캘러스 형성빈도는 $0.1\;mgl^{-1}$ IAA가 첨가된 B5 배지에 배양 시 27.3%로 가장 높았다. 본 연구에서 확립된 겨우살이 캘러스 배양 및 종자 인위 부착을 통한 식물체 재생체계는 겨우살이의 유용물질 생산 연구 및 대량증식 연구분야에 활용이 가능할 것으로 기대된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제21권3호
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• pp.293-302
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• 1997

Follicular oocytes of Grade I and II were collected from 2~6 mm ovarian follicles and matured in vitro (IVM) for 24 hrs in TCM-199 su, pp.emented with 35$\mu\textrm{g}$/ml FSH, 10$\mu\textrm{g}$/ml LH, and 1$\mu\textrm{g}$/ml estradiol-17$\beta$ at 39$^{\circ}C$ under 5% CO2 in air. They were fretilized in vitro (IVF) by epididymal spermatozoa capacitated with heparin for 12 hrs. The zygotes were then co-cultured in vitro with bovine oviducted epithelial cells (BOEC) for 7 to 9 days. The optimal time for IVM, the successful enucleation of IVM oocytes by micromanipulation at different oocyte ages after IVM, and the ideal culture system for IVM for effective IVF and in vitro development of IVM-IVF embryos was examined for in vitro production of nuclear recipient oocytes and nuclear donor embryos. To improve the efficiency of nuclear transplantation (NT) of IVF embryo into IVM follicular oocytes, this study evaluated the optimal electric condition and oocytes age for activation of IVM oocytes and in vitro development of NT embryos. In vitro development of NT embryos with preactivation or non-preactivation in enucleation oocytes, cell number of IVN-IVF embryos, and NT embryos wre also examined. The results obtained were as follows; 1. The most suitable enucleation time was at 24 hpm (83.3%) rather than that of 28 hpm(69.6%) and 32 hpm(50.0%). 2. There was no difference among the fusion rates of NT embryos at the voltages of 0.75, 1.0 and 1.5 kV/cm, but the in vitro development rates to morule and blastocyst were significantly (P<0.05) higher at the voltage of 0.75(12.5%) and 1.0kV/cm (12.6%) compared to 1.5kV/cm(0%). 3. No significant difference in activation rates were seen in NT embryos stimulated for 30, 60 and 120 $\mu$sec (71.7, 85.2 and 71.9%, respectively), but the in vitro development rates to morulae and blastocyst were significantly (P<0.05) higher in the oocytes stimulated for 30 $\mu$sec (11.6%) and 60 $\mu$sec(10.7%) than 120 $\mu$sec(0.0%). 4. The fusion rates (71.0 and 87.3%) and the in vitro development rates (9.1 and 12.7%) to morula and blastocyst were seen in the NT embryos stimulated at 28 and 32 hpm under the condition of 1.0 kV/ml, 60 $\mu$sec. However, at 24 hpm the fusion rates were 64.8% and the in vitro development to morula and blastocyst were not seen. 5. The fusion rates between the 8~12, 13~17 and 18~22-cell stage of IVM-IVF embryos were not significantly different. The in vitro development rates of the fused embryos to morula and blastocyst which were received from a blastomere of 8~12, 13~17 and 18~22-cell stages of IVM-IVF embryos were 14.9, 8.3 and 6.5%, respectively. 6. The in vitro development rate of the enucleated recipient oocytes with preactivation (24.2%) to morula and blastocyst was significantly (P<0.05) higher than that of non-preactivation (12.8%). 7. The cell numbers of NT blastocyst and IVM-IVF blastocyst cultured during 7~9 days were 63$\pm$11 and 119$\pm$23, and then their the mean cell cycle number were 5.98 and 6.89, respectively.