• 한국가축번식학회지
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• 제27권3호
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• pp.215-223
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• 2003

본 연구는 체외성숙된 돼지난포란을 액상정액으로 수정시 수정시간과 배양배지가 난포란의 발달에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다. 정자농후정액 (30∼60 ml)을 채취하여 실온에서 2시간 정도 서서히 냉각시킨 후, 정액을 15 ml 튜브에 담아 800${\times}$g로 10분간 원심분리하였다. 상층액은 버리고 하부의 정자는 5 ml LEN 희석액으로 1${\times}$$10^{9}$ 전자/ml가 되도록 재희석하였다. 희석된 정액은 4$^{\circ}C$ 냉장고에 보존하였다. 미성숙 난모세포의 성숙에 사용된 배지는 26.19 mM sodium bicarbonate, 0.9 mM sodium pyruvate, 10 $\mu\textrm{g}$/ml insulin, 2 $\mu\textrm{g}$/ml vitamin B$_{12}$ , 25 mM HEPES, 10 $\mu\textrm{g}$/ml bovine apotransferrin, 150 $\mu$M cysteamine, 10 IU/ml PMSG, 10 IU/ml PMSG, 10 IU/ml EGF, 0.4% BSA, 75 $\mu\textrm{g}$/ml sodium penicillin G, 50 $\mu\textrm{g}$/ml streptomycin sulfate그리고 10% pFF를 첨가한 TCM-199 배지였다. 22시간 성숙 배양한 후 난모세포는 cysteamine과 hormone들을 배제한 후 38.5$^{\circ}C$, 5% $CO_2$ incubator에서 22시간 더 성숙시켰다. 성숙된 난모세포는 채취 후 2일간 4$^{\circ}C$에 보존된 액상정액으로 수정되었다. 난모세포는 500 $\mu$l mTBM 수정 배지에서 1${\times}$$10^{6}$ 정자/ml의 농도로 1, 3, 6 그리고 9시간 동안 수정시켰다. 그 후 난모세포는 500 $\mu$l NCSU-23, Hopes buffered NCSU-23, PZM-3 그리고 PZM-4 배양배지에 옮겨서 6, 48 그리고 144시간을 더 배양하였다. 정자침투율, 웅성전핵형성율 그리고 난모세포의 난할율은 6 및 9시간 수정시간에서 1 및 3시간 수정시간 보다 높았다. 6시간 수정시 배반포형성율 (33.6%)은 1, 3 그리고 9시간 수정시 배반포형성율 (11.4, 23.0 그리고 29.6%) 보다 높았다. 배반포의 평균세포수는 6, 9, 3 그리고 1시간 수정시 각각 32.9, 27.6, 26.3 그리고 24.4개 였다. 분할된 난모세포의 배반포형성율 그리고 배반포의 평균세포수는 NCSU-23, PZM-3 그리고 PZM-4 배양배지보다 HEPES buffered NCSU-23 배양배지가 우수하였다. 결론적으로 4$^{\circ}C$ 보존 돼지액상정액은 체외성숙된 돼지 난모세포의 체외수정에 사용될 수 있음이 입증되었다. 또한 체외성숙된 돼지 난모세포는 500 $\mu$l mTBM 수정배지에서 1${\times}$$10^{6}$ 정자/ml로 6시간 공배양시키는 것이 바람직하며, HEPES buffered NCSU-23 배양배지에서 배양하는 것이 좋다는 결과를 얻었다.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제20권9호
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• pp.1354-1360
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• 2007

The aim of this study was to evaluate if oocytes, aspirated from postovulatory ovarian follicles of superovulated rabbits 14 h post-hCG administration, could be efficiently used as ooplasm recipients for somatic cell nuclear transfer (SCNT). Within a common SCNT protocol, a comparison between oocytes recovered by direct aspiration (aspirated) from available ovarian follicles and oocytes flushed out from oviducts (flushed) was carried out. The results showed that maturation and enucleation rates of aspirated oocytes were 70.7% and 69.2%, significantly lower than 95.3% (p<0.01) and 83.6% (p<0.05), respectively, from flushed oocytes. However, following enucleation of matured oocytes as ooplasm recipients for SCNT, no difference was recorded in fusion and cleavage rates, as well as blastocyst development from cleaved embryos or hatching of blastocysts between aspirated and flushed groups. Additionally, some matured aspirated and flushed oocytes were also used for immediate parthenogenetic activation and the resulting embryo development was not significantly different. Results from this study show the following: i) the majority of oocytes aspirated from postovulatory ovarian follicles of superovulated rabbits 14 h post-hCG administration are matured and can be used directly as ooplasm recipients for SCNT; ii) the reconstructed embryos derived from these oocytes have similar in vitro developmental ability to those flushed from the oviducts.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제13권2호
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• pp.121-127
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• 1986

We have reviewed 59 cases of patients amoung 65 cases who underwent IVF and ET with reasonable indications irom 1984 and the results as follows. 1. Major indications for IVF and ET were tubal factor (40.7%), unexplained infertility (25.4%), endometriosis (15.3%), failed AID and AIH (10.1 %), and sperm abnormality (8.5%). 2. For superovulation of human oocytes, l00mg of clomiphene citrate and 75 IU of HMG used. The monitoring of oocyte maturation was bone by ultrasound examination and serum 17-${\beta}$ estradiol, LH values. The peak $E_2$ value was 956.36${\pm}$702.13 pg/ml. 3. The oocytes were obtained by laparoscopy 24-36 hours after the injection of HCG. 4. The mean numbers of follicles at laparoscopy was 3.06 and the successful rate of laparoscopy was 79.7%. 5. And 165 follicles were aspirated from which 98 oocytes were recovered, 59.4% of all follicles had at least one oocyte aspirated. 21.4% of the eggs were mature, 52.0% were moderate, 26.5%. were immature. 6. 67.3% of oocytes were cleaved and were transferred at 4-6 cell stages. 7. Four pregnancies including one chemical pregnancy and one spontaneous abortion were established by ${\beta}$-subunit, u-hCG and ultrasound examinations.

• 한국수정란이식학회지
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• 제20권2호
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• pp.105-112
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• 2005

본 연구는 재래산양에서 복제 수정란의 생산효율을 향상시키기 위한 기초 자료를 제시하고자 체세포 핵이식을 실시하여 공핵세포의 종류, 핵이식란의 활성화 처리 방법 및 수핵난자의 조건이 체외발달율에 미치는 영향을 조사, 검토하여 핵이식란 생산을 위한 최적의 조건을 규명하고자 실시하였다. 공핵세포의 종류에 따른 핵이식란의 체외발달율은 융합이 이루어진 핵이식란의 활성화 처리 후 분할율은 귀 유래 섬유아세포를 공핵세포로 사용하였을 때가 $40.5\%$로서 태아 유래 섬유아세포를 공핵세포로 사용하였을 때의 $55.5\%$와 유의적인 차이가 없었다. 또한 상실배 또는 배반포기로의 발달율도 각각 $6.7\%$ 및 $16.0\%$로서 유의적인 차이가 없었다. 핵이식란의 활성화 방법에 따른 체외발달율은 ionomycin+6-DMAP 처리를 하였을 때 분할율은 $79.0\%$로서 전기자극을 주었을 때의 $9.5\%$보다는 유의적(P<0.05)으로 높았다. 상실배 또는 배반 포기로의 발달율도 ionomycin+6-DMAP 처리를 하였을 때는 $15.6\%$가 발달하였으나, 전기 자극을 주었을 때는 4-세포기 이후로의 발달이 전혀 이루어지지 않았다. 체세포 핵이식란은 단위발생란에 비하여 분할율$(66.1\%\;vs\;59.18\%)$ 및 상실배 또는 배반포배로의 발달율$(19.0\%\;vs\;0.0\%)$이 유의적 (P<0.05)으로 낮았다. 단위발생란의 분할율은 체내 성숙난자에서 $86.8\%$로서 난포란의 $69.0\%$보다는 유의적(P<0.05)으로 높았다 단위발생란의 상실배 또는 배반포기로의 발달율에 있어서도 체내 성숙난자$(50.0\%)$가 난포란$(23.6\%)$보다 유의적 (p.<0.05)으로 발달율이 높았다. 이상의 결과로 볼 때 재래산양의 체세포를 이용한 복제수정란의 생산효율을 향상시키기 위해서는 다수의 난자 확보를 위한 과배란처리 방법의 개선, 난포란의 이용효율 개선 및 활성화 처리방법 등이 확립되어야 하며, 후기배로의 발달율 향상을 위해서는 최적의 체외 배양조건 확립이 시급한 것으로 생각된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제22권2호
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• pp.107-110
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• 2007

본 연구는 BPA 및 nicotine 첨가 농도와 배양 시간이 돼지 난자의 체외성숙에 미치는 영향을 조사하였다. $0.02{\sim}10.0mM$ BPA와 $0.5{\sim}10.0mM$ nicotine이 첨가된 TCM-199배양액에서 $40{\sim}52$시간 난자를 배양했을 때 체외성 숙율을 조사하였다. BPA농도가 높을수록 체외성숙율이 유의적으로 낮게 나타났다. $0.05{\sim}10.0nM$ BPA를 첨가한 TCM-199 배양액에서 난자를 44시간 배양했을 때 체외성숙율은 각각 $40.0{\pm}4.1%,\;24.0{\pm}4.7%,\;10.0{\pm}5.3%,\;6.0{\pm}3.2%,\;0.0{\pm}0.0%$로서 첨가 농도가 증가할수록 낮은 체외성숙율을 나타냈다. 난자를 $0.5{\pm}10.0mM$ nicotine를 첨가한 TCM-199 배양액에서 44시간 배양했을 때 체외성숙율은 각각 $44.0{\pm}4.5%,\;24.0{\pm}4.2%,\;18.0{\pm}4.9%,\;8.0{\pm}2.2%,\;0.0{\pm}0.0%$로서 대조군$(52.0{\pm}4.5%)$에 비해 낮은 체외성숙율을 나타냈다. 난자를 0.5 nM BPA와 2.5 mM nicotine을 첨가한 TCM-199에서 $40{\sim}52$시간 배양했을 때 체외성숙율은 $8.3{\pm}2.1%{\sim}26.0{\pm}3.9%$ 및 $11.2{\pm}2.2%{\sim}28.6{\pm}3.9%$로서, 44시간 배양이 다른 배양시간보다 가장 높은 체외성숙율을 나타냈다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제23권3호
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• pp.303-310
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• 1996

본 연구는 epidermal growth factor (EGF)가 처리된 돼지 체외성숙란의 채외수정 후 배발달을 조사하기 위하여 실시하였다. 난구세포가 치밀한 미성숙란은 TCM 199 배양액에 (1) 무처리군 (2) 10 ng/ml EGF 처리군 (3) 10 ${\mu}g/ml$ FSH와 10% FBS 처리군 (4) 10 ng/ml EGF와 10 ${\mu}g/ml$ FSH 그리고 10% FBS 처리군으로 나누어 42시간 동안 배양하였다. 실험 1은 이들 처리군을 수정 후 NCSU (0.4% BSA) 배양액에서 배양하여 후기 배발달을 조사하였다. 그 결과 (3)과 (4)처리군 (13.4, 18.3%)의 배반포로의 발달율이 (2) 처리군(5.2%, p < 0.005)보다 현저하게 높았지만, (2) 처리군의 경우 (1) 처리군(1.2%, p < 0.005)의 배반포로의 발달보다는 현저하게 높았다. 실험 2는 수정 이후 6일째 이들 처리군에서 생산된 배반포기배를 double staining (propidium iodide and bisbenzimide) 방법을 이용하여 세포수를 조사하였다. 그 결과 (4) 처리군 (58.80 ${\pm}$ 11.90)의 배반포의 total 세포수가 (2)와 (3) 처리군 (42.17 ${\pm}$ 9.97, 49.07 ${\pm}$ 9.77, p < 0.05)보다 현저하게 많았으며, 배반포의 ICM 수에 있어서도 (4) 처리군 (11.69 ${\pm}$ 5.56)이 (2)와 (3) 처리군 (5.00 ${\pm}$ 4.24, 6.77 ${\pm}$ 4.92, p < 0.05)보다 현저하게 많았다. 더 우기 (4) 처리군 (19.0 ${\pm}$ 1.6)의 total 세포수에 대한 ICM의 비율이 (2)와 (3) 처리군 (11.1 ${\pm}$ 3.0, 12.7 ${\pm}$ 2.1) 보다 높았다. 이들의 결과로서, EGF가 단독 처리된 돼지 체외성숙란은 비록 낮았지만 배반포로 발달할 수는 있으나, 체외성숙시 FSH와 FBS의 추가 첨가는 높은 배반포로의 발달과 total 세포수와 ICM의 증가를 가져올 수 있음을 알수 있었다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제22권3호
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• pp.155-160
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• 2007

본 연구는 돼지 체외수정란 생산효율을 향상시켜 돼지의 품종개량, 형질전환 돼지생산 등과 멸실위험에 처해 있는 유전자원의 보존을 위한 기술로 활용하기 위해 미성숙 난포란의 적정 체외성숙 시간을 알아보고, 배양액의 종류 및 체외 배양시의 산소 농도에 따른 체외수정란의 생산 효율을 확인한 결과는 다음과 같다. 1. 돼지 미성숙 난포란의 체외성숙 시간별 제2감수분열중기(M II)까지 성숙된 비율이 체외성숙 38, 40, 42시간째에 각각 61.1%, 42.9% 및 69.6%를 나타내어 그 비율이 70% 미만으로 낮은 반면, 체외성숙 44, 46, 48시간째에 각각 73.7%, 94.1% 및 100%의 체외성숙률을 나타내어 최소한 44시간 이상의 체외성숙이 필요한 것으로 조사되었다. 2. 체외배양액의 종류에 따른 배반포 발달률이 NCSU-23 18.8%, PZM-5 16.3%를 나타내어 유의적인 차이를 보이지 않았으며(p>0.05), 산소분압에 따른 배반포 발달률이 5% 산소분압에서 11.9%, 20%의 산소분압에서 15.8%를 나타내어 두 군간의 유의한 차이는 보이지 않았다(p>0.05). 3. 체외배양 7일째 발달된 배반포 수정란의 총세포수는 40개 내 외를 나타내었다. 이상의 결과, 돼지 미성숙 난포란의 체외성숙 시간은 44시간 정도가 적정한 것으로 확인되었으며, 서로 다른 배양액과 산소농도가 돼지 체외수정란의 배발달에 있어서 유의적인 차이를 나타내지는 못하였다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제28권2호
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• pp.83-87
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• 2004

본 연구는 돼지의 난포란을 체외에서 성숙, 수정시킨 체외수정란의 체외배양 체계를 확립하고 그 기작을 규명하기 위하여 체외배양액에 항산화제인 melatonin의 첨가 및 melatonin과 sodium nitroprusside(SNP)의 첨가배양이 체외수정란의 체외발육에 미치는 영향을 검토하고자 실시하였다. NCSU 23 배양액에 melatonin을 0, 1, 5 및 10nM을 첨가하여 체외배양을 실시한 결과, 배반포기까지 발육율은 17.8%, 26.1%, 20.0% 및 16.3%로서 melatonin 1nM 첨가구가 여타구에 비해 통계적으로 유의하게 높은 성적을 나타냈으며(P<0.05), 상실배기 이상 발육 성적에서도 melatonin 1 nM 첨가구가 39.1%로서 대조구 33.3%, 5 nM 첨가구의 33.3% 및 10 nM 첨가구의 27.9%보다 높은 발육율을 나타냈다(P<0.05). NCSU 23 배양액에 SNP를 0, 50 및 100 $\muM을 첨가하여 체외 배양한 결과, 상실배 이상 발육성적은 각각 41.9%, 25.6% 및 28.4%로서 SNP 첨가구가 대조구보다 유의적으로 낮은 성적을 나타내었다(P<0.05). NCSU 23 배양액에 대조구, SNP 50 $\muM, SNP 50 $\muM에 melatonin 1, 5 및 10nM을 혼합첨가하여 체외 발육율을 조사한 결과, 배반포기 발육율은 각각 2.5%, 1.2%, 9.9%, 5.1% 및 3.7%로서 SNP 50$\mu$M + Mel. 1nM 첨가구가 여타구 보다 높은 성적을 나타냈으며, 상실배기 이상 체외 발육율은 31.3%, 34.1%, 39.5%, 29.4% 및 39.5%로서 SNP 50 $\mu M + Mel. 1 nM 첨가구와 SNP 50 $\muM + Mel. 10 nM 첨가구가 여타구보다 높은 발육율을 나타냈다. 모든 처리구에서 배반포까지 발육된 체외수정란의 세포수는 커다란 차이가 인정되지 않았다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제30권2호
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• pp.73-82
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• 2015

This study was designed to evaluate the possibility of increase through dairy female offspring's ratio by transfer of pre-selected transferrable blastocyst that was produced by pre-selected X-bearing semen with OPU derived oocytes. Elite dairy female cow is demanded strongly compared with male, the so called, farmer wants to produce only an elite female dairy offspring as a candidate female dairy cow for producing milk. In our study, we selected 2 elite dairy bull semen from National Agricultural Cooperative Federation to pre-select X-bearing semen and 5 elite dairy female cows as donor for collecting of OPU derived oocytes. OPU derived embryo production system was carried out an aspiration of immature oocytes from 5 donor cows 2 times per week, total 200 times for 2 to 7 months by an ultrasonographic guided follicular aspiration system and then produced in vitro-produced blastocysts by in vitro maturation, fertilization and culture. Dairy donor semen selected H-319, 320 bull in National Agricultural Cooperative federation was sorted X-bearing semen by flow-cytometer and frozen for using IVF with OPU derived oocytes. Donor cows were selected 5 elite dairy cows from Gyeongju Dairy Cow Community and then disease tests such as 4 kinds of disease before selecting was checked. Oocyte proportion of grade 1 to 3 from total collected oocytes was significantly lower in donor A and B than those in donor C, D and E (82.16 and 70.03% vs. 90.0, 91.78 and 93.57%), respectively (p<0.05). However, number of oocytes per session in donor A, C and E was significantly higher than those in donor B and D ($7.77{\pm}3.26$, $5.85{\pm}2.10$ and $7.03{\pm}2.14$ vs. $4.68{\pm}2.61$ and $5.21{\pm}1.97$ oocytes), but donor A was significantly higher than donor C (p<0.05). Development to blastocyst in donor B, C and E was significantly higher than those in donor A and D (31.0, 25.0 and 25.0% vs. 14.3 and 4.5%), but donor A was not different in donor C and E (p<0.05). Nine out of 10 blastocysts (90.0%) derived from OPU blastocysts were confirmed male embryos that was induced with Y-bearing semen to confirm sex ratio only. Total 96 blastocysts derived from female bearing semen were transferred into synchronized recipients and then confirmed 42 recipients (43.8%) pregnancy rate, 36 offspring (37.5%) and 91.7% female sex ratio (33 female vs. 3 male offspring). Taken together all data, elite dairy female offspring could be produced effectively by in vitro production system between pre-selected x-bearing semen and OPU derived oocytes that would be influential breeder in the breeding of dairy farm to increase effectively elite dairy offspring ratio as well as net income in the dairy farmer.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제28권2호
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• pp.119-126
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• 2004

본 실험은 돼지체외수정란을 생산하는데 적합한 배양액과 산소조건을 구명하기 위하여 NCSU(North Carolina State University)-23, PZM(Porcine Zygotes Medium)-3, PZM-4 및 TCM(Tissue Culture Medium)-199 배양액과 5% 산소조건(39, 5% $O_2$, 5% $CO_2$ , 90% $N_2$ 및 포화습도) 및 20% 산소조건(39, 5% $CO_2$ 및 포화습도)에서 돼지 미성숙난포란의 체외성숙과 체외배발달을 실시하였다. 본 연구에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 돼지 난포란을 5 및 20% 산소조건하에서 NCSU-23, PZM-3, PZM-4 및 TCM-199 배양액에 44시간 동안 성숙을 유도한 결과 난핵포붕괴율과 핵성숙률에 있어서 산소조건 및 배양액간 유의적(p>0.05)차이는 없었다. 2) 체외수정을 실시한 결과 정자 침투율, 자ㆍ웅전핵형성률, 다정자 침입률 및 평균정자수에 있어서 산소조건 및 배양액간에 유의적인 차이가 없었다. 3) 체외수정을 실시한 후, 5 및 20% 산소조건의 NCSU-23, PZM-3, PZM-4 및 TCM-199 배양액에서 배양하여 배발달에 미치는 영향을 조사한 결과, 난할률에 있어서는 유의적(p＜0.05)인 차이가 없었으며. 배발달 7일째 배반포기 발달률에 있어서 5% 산소조건에서는 PZM-3 배양액이, 20% 산소조건에서는 NCSU-23 배양액이 유의적(p＜0.05)으로 높은 결과를 나타냈다. 4) 배발달 7일째 배반포기 배의 세포수를 조사한 결과, 내부세포괴세포수와 총세포수는 산소조건과 배양액간에 통계적인 유의성이 인정되지는 않았으나, 5% 산소조건에서 PZM-3 배양액(36.8$\pm$6.5개)이 다소 높은 총세포수를 나타냈다. 위의 결과를 종합하면 돼지체외수정란의 생산에는 5% 산소조건에서 PZM-3 배양액에서 배발달을 유도하는 것이 배반포기 발달률과 세포수에 있어 효과적이라고 판단된다.