• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제19권8호
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• pp.829-835
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• 2009

A dextransucrase (LcDS) gene from Leuconostoc citreum HJ-P4 has been amplified and cloned in E. coli. The LcDS gene consists of 4,431 nucleotides encoding 1,477 amino acid residues sharing 63-98% of amino acid sequence identities with other known dextransucrases from Leuc. mesenteroides. Interestingly, 0.1 mM of IPTG induction at $15^{\circ}C$ remarkably increased the LcDS productivity to 19,187 U/I culture broth, which was over 330-fold higher than that induced at $37^{\circ}C$. Optimal reaction temperature and pH of LcDS were determined as $35^{\circ}C$ and pH 5.5 in 20 mM sodium acetate buffer, respectively. Meanwhile, 0.1 mM $CaCl_2$ increased its activity to the maximum of 686 U/mg, which was 2.1-fold higher than that in the absence of calcium ion. Similar to the native Leuconostoc dextransucrase, recombinant LcDS could successfully produce a series of isomaltooligosaccharides from sucrose and maltose, on the basis of its transglycosylation activity.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제32권2호
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• pp.135-141
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• 2004

인간 과립구 성장인자(hG-CSF)는 골수에서 생산되는 단백질로 호중구의 분화 및 생성을 촉진시키는 역할을 한다. 현재 재조합 hG-CSF는 암화학요법에 의한 호중구감소증, 골수이식시 호중구 감소증, 재생불량성 빈혈에 수반되는 호중구 감소증 등으로 적응증이 확대되고 있다. 본 연구에서는 OmpA signal sequence를 삽입하여 인간 과립구 성장인자(hG-CSF)가 분비발현되도록 고안된 T7 promoter 에 의하여 발현되는 pYRCl 발현백터를 제조하였다. E. coli BL2l (pYRCl) 발현시 $37^{\circ}C$에서 배양하는 경우 많은 양의 봉입체(aggregates)를 형성한다. 이에 비하여 $10\mu$M ucose를 포함하는 변형된 MBL배지에서 10 g/$\ell$IPTG를 유도물질로 7시간동안 $25^{\circ}C$에서 배양하였을 때 전체 periplasm단백질의 15%가 soluble rhG-CSF이었다. 또한, 유가식 배양방법을 사용하여 E. coli BL2l(pYRCl)에서 soluble rhG-CSF의 생산조건을 조사하였다. 유가식 배양에서 rhG-CSF의 발현량이 비증식속도를 $0.43 h^{-1}$ 에서 0.14 $h^{-1}$ 으로, 유도 배양시간을 최적화함으로써 rhG-CSF의 발현량이 4.4mg/$\ell$에서 24mg/$\ell$ 로 증가하였다.

• 미생물학회지
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• 제31권4호
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• pp.279-285
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• 1993

p53 유전자의 변화는 인간의 여러 암에서 가장 흔하게 발견되며 종양세포내에서는 이러한 변형된 p53 단백질의 양의 증가가 초래된다. 세포내에 축적된 p53 단백질의 발견은 인간의 암증세를 판단할 유용한 기중이 되기도 한다. 본 연구에서는 이러한 면역조직화학 검사에 쓰일 수 있는 폴리클로날 항체를 만들기 위햐여 사람의 p53 유전자를 glutathione S-transferase 와의 융합 단백질의 형태로서 대장균내에서 발현시켰다. p53 의 아미노산 1-158번을 코딩하고 있는 NeoI fragment 와 아미노산 159-393 번을 코딩하는 NocI-BamHI fragment 를 BamHI linker 를 이용하여 in frame 으로 pGEX-2T 의 BamHI 자리에 삽입하여 재조합 플라스미드 pGTNS 와 pGTNL 을 각각 만들었다. 또 PCR 에 의한 증폭에 의햐여 아미노산 38-145번을 코딩하는 유전자 부위를 증폭하였으며 BamHI 과 PvuII 로 절단하여 pGEX-2T의 BamHI 과 SmaI 자리에 삽입함으로써 pGTBP 를 제조하였다. 이들 재조합 균주들을 IPTG 로 4시간 induction 한 후 세포 추출물로부터 glutathione Sepharose bead 를 이용하여 융합단백질을 분리하였다. Bead 에 결합된 단백질은 10% SDS-polyacrylamide gel 에서 전기영동하였으며, 각각의 분자량은 54 kDa, 53 kDa 와 40 kDa 였다. 이러한 방법으로 1리터 배양으로부터 약 1mg 의 단백질을 정제하였다.

• 미생물학회지
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• 제39권4호
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• pp.216-222
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• 2003

Caspase는 세포사멸 과정에서 중심적 역할을 하는 cysteine 단백분해 효소이다. 그 중 caspase-9은 활성이 없는 전장 단백질로 존재하지만 Apaf-1과 cytochrome c와 함께 apoptosome을 이루면 활성화된다. 활성 된 caspase-9은 다른 caspase들을 활성 시키는 중요한 기능을 갖는다. 본 연구에서는 대장균에서 전장 caspase-9 단백질을 정제하고자 pGEX 발현 시스템을 이용하였다. 그러나 일반적 배양 및 유도조건에서 caspase-9을 발현시키면 과다한 단백분해로 인하여 전장 caspase-9 단백질이 매우 적게 발현되었다. 이를 극복하기 위해 배양조건과 유도인자의 농도를 변화시키자 caspase-9의 과다한 단백분해 현상이 감소되고 전장 caspase-9의 발현 정도도 상당량 향상되었다. 본 연구에서 확립된 배양조건으로 caspase-9을 발현, 정제하면 70%이상의 순도를 가진 GST-caspase-9 단백질을 손쉽게 얻을 수 있다. 더불어 GST 융합 caspase-9이 대장균에서 발현될 때도 포유세포 내에서 절단되는 것과 동일한 위치인 Asp315 에서 자가 단백분해 반응이 일어난다는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 caspase-9의 생화학적, 세포생물학적 기능연구에 필요한 전장 단백질을 다량으로 확보할 수 있는 간단하고 효과적인 정제방법을 제안한다.

• 생명과학회지
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• 제15권6호
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• pp.916-922
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• 2005

E3 ligase로 알려진 Parkin은 protein quality control에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 이런 quality control system의 이상으로 나타나는 퇴행성 뇌질환에도 밀접한 연관성이었다. 이와 같이 생체의 필수적인 업무를 담당하는 Parkin의 기능을 생화학적 측면에서 연구하기 위해서는 고 순도의 단백질을 다량 정제할 수 있는 시스템이 필요하나, 아직까지 Parkin의 발현 양상과 정제법에 관한 연구가 미흡한 상태이다. 본 연구에서는 pCEX system을 이용하여 Parkin을 대장균에서 overexpression시켜 단일 스텝으로 정제할 수 있는 방법을 정립하였다. 저온의 배양조건에서 0.01 mM의 IPTC로 발현을 유도한 결과 $90\%$ 이상의 순도를 가지는 완전한 크기의 Parkin을 정제할 수 있었다. 또한, 여러 tag을 갖는 Parkin plasmid를 제작하였을 뿐만 아니라, 이들을 HEK293 세포에 transfection하여 Parkin의 발현 양상을 비교 분석하였다. 그 결과 Parkin의 N-말단에 pretense에 민감한 절단 부위가 존재한다는 사실을 확인하였다. 본 연구에서 정립한 Parkin 정제법과 포유류 세포에서 Parkin의 발현 양상에 대한 결과는 Parkin의 기질을 탐색하고,그들이 Parkin의 효소 활성 및 기능에 미치는 영향을 조사하기 위한 다양한 연구에 활용할 수 있을 것이다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제22권4호
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• pp.510-515
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• 2012

A recombinant putative dextransucrase (DexT) was produced from Leuconostoc citreum KM20 as a 160 kDa protein, but its productivity was very low (264 U/l). For optimization, we examined enzyme activity in 7 Escherichia coli strains with inducer molecules such as lactose or IPTG. E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL exhibited the highest enzyme activity with lactose. Finally, DexT activity was remarkably increased by 12-fold under the optimized culture conditions of a cell density to start induction ($OD_{600}$) of 0.95, a lactose concentration of 7.5 mM, and an induction temperature of $17^{\circ}C$. These results may effectively apply to the heterologous expression of other large DexT genes.

• Journal of Microbiology
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• 제44권3호
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• pp.293-300
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• 2006

The Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit (HLT-B) is one of the most powerful mucosal immunogens and known mucosal adjuvants. However, the induction of high levels of HLT-B expression in E. coli has proven a difficult proposition. Therefore, in this study, the HLT-B gene was cloned from pathogenic E. coli and expressed as a fusion protein with GST (glutathion S-transferase) in E. coli BL2l (DE3), in an attempt to harvest a large quantity of soluble HLT-B. The culture conditions, including the culture media used, temperature, pH and the presence of lactose as an inducer, were all optimized in order to obtain an increase in the expression of soluble GST-rHLT-B. The biological activity of the purified rHLT-B was assayed in a series of GMI-ELISA experiments. The findings of these trials indicated that the yield of soluble recombinant GST-rHLT-B could be increased by up to 3-fold, as compared with that seen prior to the optimization, and that lactose was a more efficient alternative inducer than IPTG. The production of rHLT-B, at 92 % purity, reached an optimal level of 96 mg/l in a 3.7 L fermentor. The specific GM1 binding ability of the purified rHLT-B was determined to be almost identical to that of standard CTB.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제24권4호
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• pp.478-484
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• 1996

Recombinant human epidermal growth factor (rhEGF) was produced by E. coli BL21 harboring a plasmid pYHB101. The maximum production was 68.7 mg/l when the E. coli strain was cultured at 25$\circ$C for 48 hours in the modified MBL medium containing 10 g/l glucose with 1 mM IPTG induction at 2 hours after inoculation. The rhEGF was purified upto 267 folds by Amberlite XAD- 7 chromatography, ultrafiltration, and DEAE Sepharose fast flow ion exchange chromatography with an overall yield of 66.6%. The purified rhEGF was further separated into two fractions by HPLC. The N-terminal amino acid sequence of the second fraction was Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His. The effect of rhEGF on the DNA synthesis was examined using in vitro biological assay based on the incorporation of 5'-bromo-2'- deoxy-uridine (BrdU). The purified rhEGF shows no difference with natural human epidermal growth factor (nhEGF) in N-terminal amino acids residues and biological activity. From the results, we concluded that rhEGF produced from E. coli harboring the plasmid pYHB101 was apparently the same as nhEGF.

• Journal of Life Science
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• 제9권1호
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• pp.54-57
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• 1999

We have got several clones from Serratia marcescens which stimulated the cells to use maltose as a carbon source in E. coli TP2139 (${\Delta}$lac, ${\Delta}$crp). One of the cloned genes, pCKB13, was further analyzed. In order to find whether the increased expression of the gene under the direction of maltose metabolism, we constructed several recombinant subclones. We have confirmed that the clone, pCKB13 codes Coenzyme A transferase gene by partial nucleotide sequencing in the terminal region. The enzyme activity of Coenzyme A transferase increased after introduction of the multicopy of the cloned gene in E. coli. The recombinant proteins expressed by multicopy and induction with IPTG, two polypeptide of 26-and 28-kDa, were confirmed by SDS-PAGE. Southern hybridization analysis confirmed that the cloned DNA fragment was originated from S. marcescens chromosomal DNA.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제19권12호
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• pp.1620-1627
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• 2009

The design and expression of an antihypertensive peptide multimer (AHPM), a common precursor of 11 kinds of antihypertensive peptides (AHPs) tandemly linked up according to the restriction sites of gastrointestinal proteases, were explored. The DNA fragment encoding the AHPM was chemically synthesized and cloned into expression vector pGEX-3X. After an optimum induction with IPTG, the recombinant AHPM fused with glutathione S-transferase (GST-AHPM) was expressed mostly as inclusion body in Escherichia coli BL21 and reached the maximal production, 35% of total intracellular protein. The inclusion body was washed, dissolved, and purified by cation-exchange chromatography under denaturing conditions, followed by refolding together with size-exclusion chromatography and gradual dialysis. The resulting yield of the soluble GSTAHPM (34 kDa) with a purity of 95% reached 399 mg/l culture. The release of high active fragments from the AHPM was confirmed by the simulated gastrointestinal digestion. The results suggest that the design strategy and production method of the AHPM will be useful to obtain a large quantity of recombinant AHPs at a low cost.