Background: Hu syndrome, a neurological disorder, is characterized by the remote effect of small cell lung cancer on the neural degeneration. The suspicious effectors for this disease are anti-Hu autoantibodies or Hu-related CD8+ T lymphocytes. Interestingly, the same effectors have been suggested to act against tumor growth and this phenomenon may represent natural tumor immunity. For these diagnostic and therapeutic reasons, the demand for antibodies against Hu protein is rapidly growing. Methods: Polyclonal and monoclonal antibodies were generated using recombinant HuR protein. Western blot analyses were performed to check the specificity of generated antibodies using various recombinant proteins and cell lysates. Extracellular stimuli for HuR expression had been searched and HuR-associated proteins were isolated from polysome lysates and then separated in a 2-dimensional gel. Results: Polyclonal and monoclonal antibodies against HuR protein were generated and these antibodies showed HuR specificity. Antibodies were also useful to detect and immunoprecipitate endogenous HuR protein in Jurkat and BJAB. This report also revealed that TNF-${\alpha}$ treatment in BJAB up-regulated HuR expression. Lastly, protein profile in HuR-associated mRNAprotein complexes was mapped by 2-dimensional gel electrophoresis. Conclusion: This study reported that new antibodies against HuR protein were successfully generated. Currently, project to develop a diagnostic kit is in process. Also, this report showed that TNF-${\alpha}$ up-regulated HuR expression in BJAB and protein profile associated with HuR protein was mapped.
The mutagenic potential of rHu-EPO was evaluated using the short-term genotoxicity tests including Ames, chromosome aberration and micronuclei tests. In Salmonella typhimurium assay, rHu-EPO did not show any mutagenic response in the absence or presence of S9 mix with TA98, TA100, TA1535, and TA1537. In chromosome aberration test, rHu-EPO did not show any significant effect on Chinese Hamster Ovary(CHO) cells compared with control. In micronucleus test using male ICR mice, a dose-dependence increase in the frequency of micronucleuted polychromatic erythrocytes(MNPCEs) was observed in bone marrow cells treated with rHu-EPO. However, it was related to the secondary effect of rHu-EPO and the number of MNPCEs was equal to spontaneous frequency. These results indicate that rHu-EPO does not show any positive response in short-term genotoxicity assays.
Efficacy and general pharmacology of recombinant human erythropoietin (rHu-EPO), were investigated. Efficacy studies were conducted in normal, cisplatin- and acute hemorrhage-induced anemic rats. Normal and anemic animals were treated intravenously with rHu-EPO for 5 days and the changes in the numbers of red blood cells (RBC), hemoglobin (Hb), hematocrit (Hct) and reticulocytes (Ret) were examined. In normal rats, rHu-EPO significantly increased RBC, Hb, Hct and Ret at doses of 50∼ 1250 IU/kg/day. Cisplatin-induced anemic rats showed significant increase of RBC, Hb, Hct and Ret in a dose-dependent manner after administration of rHu-EPO (50∼200 lU/kg/day). And in acute hemorrhage-induced anemic rats, rHu-EPO(4∼100 Iu/kg/day) accelerated recovery of anemia with significant increase in Ret. These changes disappeared gradually after cessation of the treatment. The general pharmacological effects of rHu-EPO were investigated in mice, rats, guinea-pigs, rabbits and cats. rHu-EPO had no influences on central nervous, cardiovascular, gastrointestinal and blood coagulation system. It also had no influence on the contraction of phrenic nerve-diaphragm preparation. rHu-EPO produced significant increase of urine volume at a dose of 7000 IU/kg. These results suggest that rHu-EPO might be useful for the therapy of anemia without serious side effect.
신 부전 환자에게 발생하는 빈혈의 원인은 여러 가지가 있다. 그러나 rHuEPO를 투여할 시 이러한 요인들을 극복하고 빈혈을 교정할 수가 있다. 하지만 약 10%의 환자들에서는 고용량의 rHuEPO에도 불구하고 rHuEPO 저항성 빈혈을 나타낸다. 이러한 경우 DFO는 이러한 저항성을 극복할 수 있다고 하며, 이에 대한 기전은 아직 논란이 많다. 따라서 저자들은 DFO를 투여시 나타나는 여러 인자들을 고려해보고 기존의 보고보다 장기적인 관찰을 통하여 이러한 환자에게서 DFO가 빈혈을 교정할 수 있을지 여부를 알아보고 DFO가 rHuEPO 저항성 빈혈을 극복하는 기전을 추측해보고자 하였다. 영남대학교 의과대학 부속병원 투석실에서 투석을 시행하는 만성 신부전 환자 중 rHuEPO의 효과에 저항성을 나타내는 7명의 환자가 실험군(DFO+EPO)으로 정해지고, 다른 7명이 대조군으로 선정되었다. 실험군은 주당 4000 U의 고용량의 rHuEPO에도 불구하고 혈색소치가 9 g/dL이하 이며 출혈이나 철결핍성 빈혈같은 뚜렷한 원인 없이 정구성 정색소성 빈혈을 나타낸 환자들이었으며 대조군은 나이, 평균 투석 기간에 있어서 대조군과 차이를 보이지 않으며 rHuEPO에 비교적 적절한 반응을 보이는 환자들이었다. DFO는 8주간 rHuEPO와 함께 투여 되어 졌고 rHuEPO의 사용 용량은 지난 6개월의 평균 용량과 같게 투여 되었다(평균 사용 용량은 123.5 U/Kg/Wk). 8주간 DFO가 투여된 후 15 개월간 혈색소치와 rHuEPO 사용 용량을 추적하였다. 이 15개월간은 각 개인의 혈색소치와 경제 사정에 의해 rHuEPO의 용량이 결정지어 졌다. 대조군에서는 같은 기간 실험군에서와 같은 방법으로 rHuEPO가 투여되어 졌으나 DFO는 사용되지 않았다. DFO가 투여된 15 개월의 추적기간은 Time I(DFO투여후 7개월간)과 Time II(Time I 이후 8개월간)으로 나누었다. 성적은 다음과 같다: DFO 투여 전, 실험군의 평균 혈색소치는 대조군과(평균 8.2 g/dL) 같은 정도의(p>0.05) 수준인 7.8 g/dL 이었다. 하지만 rHuEPO의 사용 용량은 평균 123.5 U/Kg/Wk으로서 대조군의 그것(평균 41.6 U/Kg/Wk)보다 의미있게 많은(p<0.05) 용량을 사용하여 rHuEPO에 대한 저항성을 나타내었다. 하지만 DFO사용후 실험군에서 혈색소치는 의미있게 상승되었고(p<0.05) 이것은 Time II에 이르기까지 지속되었다(Time I; 평균 8.6 g/dL, Time II; 평균 8.6 g/dL). 즉, 혈색소치에 대한 DFO의 효과는 투여 후 15 개월간 Time I, Time II의 시기에 걸쳐 균등한 정도로 지속되었다. 또한 실험군에서 rHuEPO의 사용 용량은 DFO투여후 대조군과 유사한 수준으로 감소하였고 이것도 마찬가지로 15개월간 지속되었다(Time I; 평균 48.1 U/Kg/Wk. Time II; 평균 51.8 R/Kg/Wk. 한편, 같은 기간 대조군에서의 혈색소치와 rHuEPO사용 용량의 변화는 없었다. 특히, 실험군에서 혈색소치의 증가와 rHuEPO의 사용 용량의 감소는 DFO투여 후 1개월동안에 극대점을 이루었다. 즉, DFO 사용 후 감소된 rHuEPO사용 용량으로도 조혈 작용을 증강시킬 수 있었고 따라서 DFO를 사용함으로써 rHuEPO의 저항상을 극복할 수 있으리라고 생각된다. 보다 대규모의 실험과 잠재적으로 위험한 DFO의 부작용을 최소화 할 수 있는 적절한 용량과 투여 방법에 대한 연구가 더 필요하다고 사료된다.
This study was conducted to investigate the subacute intravenous toxicity of rHu-EPO in Sprague-Dawley rats. rHu-EPO was daily administered to male and female rats for 30 days with different dose levels(100, 500, 2,500 unit/ kg). After the administration period of 30 days, 5 males and 5females rats per each dose group were assigned for recovery period of additional 30 days. There were no clinical signs compared with control group but slight decrease in spontaneous motor activities and locomotions were observed at high dose groups of males and females. In males, feed consumption was reduced at 500 unit/kg and body weight gain was retarded. In the administration sites of tail, focal congestion was observed in a few animals treated with rHu-EPO. No deaths were occurred during the course of study. In hematological examination. a significant increase of hemoglobin and hematocrit was observed in the males and females rats receiving high dose of rHu-EPO. rHu-EPO administration for 30 days showed a marked decrease in glucose concentration. At the highest dose groups, there was a significant incerase in the weights of spleens in both sexes. but this was considered to be related to its pharmacological activity. These results indicate that rHu-EPO does not induce any significant toxic effect on Sprague-Dawley rats for 30 days.
1991년 1월부터 1993년 2월까지 영남대학교 의과대학 부속병원에서 출생하여 신생아 중환자실에서 치료 받았던 12명의 미숙아를 대상으로 무작위로 대조군과 rHuEPO투여군으로 나누어 체중 kg당 100unit의 rHuEPO을 1주간 3회씩 4주동안 피하주사하고 rHuEPO투여 시작과 같이 체중 kg당 3mg의 elemental iron을 매일 경구투여 하였고 출생 후 수유가 가능할 때 부터 25unit씩의 비타민 E를 매일 경구투여 하였다. 망상적혈구, 혈색소치, 백혈구수, 혈소판수, 혈청 철, ferritin, 총 철결합능, erythropoietin농도, 활력징후, 체중, 간기능, 신장기능 및 피하주사부 위의 국소 부작용을 비교해 본 결과 치료 시작전 erythropoietin의 농도는 대조군과 rHuEPO투여군 사이에 차이는 없었으며 모두 정상 범위에 속했고 rHuEPO투여군에서는 치료 1주에서 3주사이에 급격한 망상적혈구의 경향이 관찰되었고 전반적으로 혈색소치, 백혈구수, 혈소판수, 혈청 철, ferritin, TIBC등에서는 차이가 없었다. 그리고 체중증가 및 활력증상, 간기능, 신장기능에서도 대조군과 rHuEPO투여군 사이에서 차이가 없었고 rHuEPO 투여 기간 동안 계속 정상적으로 유지되었다. 결론적으로 우리의 연구에서는 rHuEPO치료로 뚜렷한 혈색소치 및 헤마토크리의 증가를 볼 수 없었지만 망상적혈구가 치료 초기에 증가되는 경향이 관찰되었고 치료로 인한 특이할 만한 부작용이 없었으므로 첫째, 치료 기간 중의 예견할 수 없이 발생하는 패혈증, 무시할 수 없는 채혈량과 spontaneous endogenous erythropoietin생산이 rHuEPO의 반응에 미치는 영향, 둘째. rHuEPO의 가장 높은 효과를 얻기 위한 보다 적절한 투여용량, 기간 및 rHuEPO의 투여를 출생 후부터 바로 예방 목적으로 할 것인지 또는 출생 몇 주 후부터 rescue therapy로 할 것인지 투여 시작 시기, 셋째, 용량의 증가 및 감소에 동반되는 부작용의 정도등을 고려해서 앞으로 더 많은 미숙아를 대상으로 지속적인 연구를 한다면 rHuEPO을 이용해 더욱 더 활발하고 효과적으로 미숙아 빈혈을 치료할 수 있으리라 기대한다.
The distribution features of recombinant human $alpha-interferon(rHuIFN-{\alpha}A)$ and $^{14}C-radiolabeled\;rHuIFN-{\alpha}A\;(^{14}C-rHuIFN-{\alpha}A)$ were investigated in ICR mice after i.v. injection. The level of $rHuIFN-{\alpha}A$ in the kidney was significantly higher than those in lung and liver at 10min after the injection. But the level was reduced significantly at 60min. The level of radioactivity in the kidney was also significantly higher than those in other organs after i.v. injection of $^{14}C-rHuIFN-{\alpha}A$, but it was reduced at much slower speed than was $rHuIFN-{\alpha}A$. These results show that interferon is distributed repidly and the kidney is the main site of distribution and metabolism of $rHuIFN-{\alpha}A$.
A fertility study was carried out in Sprague Daxley rats which have been given the intravenous or intraperitoneal injections of rHuIFN-${\alpha}$A, a commecially available therapeutic agent, at dose levels of $1{\times}10^5$, $4{\times}10^5$ and $1.2{\times}10^6$ I.U/kg/day. Male rats were treated with rHuIFN-${\alpha}$A from 60 days before pairing and until the completion of mating. Femal rats received rHuIFN-${\alpha}$A for 22days prior to mating and up to day of gestation. All pregnant females were sacrificed on day 20 of gestation and all fetuses were examined for abnormalities. Both the male and female animals treated with rHuIFN-${\alpha}$A did not show any abnormal responses. No abnormal signs were seen in reproducibility for the rats treated with rHuIFN-${\alpha}$A. No External, internal and skeletal anomalies attributable to rHuIFN-${\alpha}$A were observed in the fetuses. It was concluded that rHuIFN-${\alpha}A$ had no harmful effect on mating, fertilization, implantation, or embryonic development.
치조골흡수는 만성치주질환의 전형적인 증상이다. 골흡수에 작용하는 여러 요인들 중에서도, 특히 최근에 들어서 몇몇 cytokine들에 대한 관심이 높아지고 있는데, interleukin-1(IL-1), tumor necrosis factor(TNF) 및 interleukin-6(IL-6) 등이 치주질환의 진행과정에서 중요한 치조골흡수요인으로 제안되고 있다. 본 연구의 목적은 신생쥐의 골조직 배양실험을 통해서 recombinant human $interleukin-1{\beta}$ ($rHuIL-1{\beta}$), recombinant human tumor necrosis $factor-{\alpha}$($rHuTNF-{\alpha}$) 및 recombinant human interleukin-6(rHuIL-6) 의 골흡수 유도효과를 알아보고, cyclooxygenase 억제제인 indomethacin과 recombinant murine $interferon-{\gamma}$($rMurIFN-{\gamma}$)가 이들 cytokine의 골흡수 유도능력에 미치는 영향을 알아봄으로써 이들 cytokine의 작용기구에 대해서 알아보고자 하는데 있다. 생후 1-2일된 쥐에게 $1{\mu}Ci^{45}CaCl_2$를 피하주사하고 4일 후에 쥐를 희생시켜 $^{45}Ca$ 로 표지된 두개골을 얻어 24시간 전배양 후, 각 cytokine ($rHuIL-1{\beta}$, $rHuTNF-{\alpha}$ 및 rHuIL-6)과 cytokine 및 첨가약제 (indomethacin 및 $rMurIFN-{\gamma}$)가 함유된 배지로 교환하여 48시간 배양한다. 골흡수 유도효과는 두개골에서 48시간의 배양 중 유리되는 $^{45}Ca$의 방사능 정도로 평가하였다. 본 연구를 통해 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. $rHuIL-1{\beta}$ ($10^{-12}-10^{-9}M$) 및 $rHuTNF-{\alpha}$ ($10^{-10}-10^{-8}M$)는 농도변화에 따르는 골흡수 유도효과를 보였으나 , rHuIL-6 ($10^{-10}-10^{-8}M$)는 유의할 만한 효과를 보이지 않았다. 2. Indomethacin ($10^{-6}M$)은 $rHuIL-1{\beta}$ 및 $rHuTNF-{\alpha}$의 골흡수 유도작용에 유의할 만한 억제효과를 나타내지 않았다. 3. $rMurIFN-{\gamma}$ (1000 U/ml) 은 $rHuIL-1{\beta}$ 및 $rHuTNF-{\alpha}$의 골흡수 유도작용에 유의한 억제효과를 나타내었다. 본연구를 통해 치주질환 환자의 치주조직에서 검출되는 $IL-1{\beta}$ 및 $TNF-{\alpha}$가 치조골 흡수에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
Acute intravenous toxicities of rHu-EPO (recombinant human erythropoietin) were investigated in Sprague-Dawley rats. Seven days after administration of rHu-EPO, we examined the clinical signs, mortalities, body weight and etc. No clinical signs and mortalities of toxicity were observed in animals. Also, a significant change of body weights was not observed. These results suggest that LD$_{50}$ value was >25,000 unit/ kg in Sprague-Dawley rats and the acute intravenous toxicities of rHu-EPO were not significant.t.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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