• Nuclear Medicine and Molecular Imaging
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• 제43권5호
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• pp.468-477
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• 2009

목적: Hydrodynamic-based procedure는 손쉽고 간편한 비바이러스성 유전자 전달 방법으로 특히 간특이적으로 발현하는 특징을 가진다. 단순 헤르페스 바이러스 제 1 형 티미딘 키나제(herpes simplex virus type 1 thymidine kinase, HSV1-tk)와 다양한 기질을 이용한 비침습적 HSV1-tk 유전자 영상시스템이 널리 연구되어왔다. 본 연구에서는 HSV1-tk 유전자를 hydrodynamic-based procedure를 이용하여 전달한 후, HSV1-tk의 보고 기질로 알려진 5-(2-iodovinyl)-2'-deoxyuridine (IVDU)을 이용하여 간 특이적인 HSV1-tk 유전자 발현 영상을 획득하고자 하였다. 대상 및 방법: HSV1-tk 유전자와 녹색형광유전자를 가진 각 플라스미드 벡터를 마우스에 hyodynaminc injection을 통해 전달하고, 24 시간 뒤 유전자의 발현을 확인하기 위해 RT-PCR, 생체형광영상, 핵의학영상, 전신자가방사영상 그리고 생체분포를 시행하였다. 결과: 각 플라스미드 벡터를 전달한 간으로부터 추출한 전체 RNA를 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과, 각각 HSV1-tk유전자와 녹색형광단백 유전자의 특이적인 밴드를 관찰할 수 있었다. 생체 분포 결과, pHSV1-tk 벡터를 전달한 마우스의 간에서 특이적인 [$^{123}I$]IVDU의 섭취를 보였다. 생체형광영상에서는pEGFP-N1 벡터를 전달한 마우스의 간에서는 유의한 형광신호를 나타내었다. 전신자가방사영상과 감마카메라 영상에서 pHSV1-tk 벡터를 전달한 마우스의 간에서 방사표지 IVDU가 국소적으로 집적되는 것을 확인하였다. 결론: 본 연구에서 hydrodynamic-based procedure는 간특이적으로 플라스미드 DNA를 전달하는데 효과적이며 전달된 유전자의 발현을 분자영상학적인 방법으로 확인하였다. 따라서 Hydrodynamic injection을 통해 HSV1-tk유전자와 목적 유전자의 공동발현은 방사표지 IVDU에 의해 목적 유전자의 발현을 정량평가하는데 유용할 것으로 기대된다.

• Molecules and Cells
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• 제21권1호
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• pp.104-111
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• 2006

Gene therapy with nonviral vectors using the suicide gene/prodrug activating system of herpes simplex virus type-1 thymidine kinase (HSV1-TK)/ganciclovir (GCV) is inefficient in killing malignant tumor cells due to two major factors: (a) an unsatisfactory bystander effect; (b) short-lived expression of the protein. To study the capacity of the protein transduction domain (PTD) of HIV-1 TAT protein to enhance HSV1-TK/GCV cancer gene therapy, we constructed three fusion proteins TAT-TK, TK-TAT and TK. TAT-TK retained as much enzyme activity as TK, whereas that of TK-TAT was much lower. TAT-TK can enter HepG2 cells and much of it is translocated to the nucleus. The transduced HepG2 cells are killed by exogenously added GCV and have bystander effects on untransduced HepG2 cells. Most importantly, the introduced recombinant protein is stable and remains functional for several days at least, probably because nuclear localization protects it from the cytoplasmic degradation machinery and provides access to the nuclear transcription machinery. Our results indicate that TAT fusion proteins traffic intercellularly and have enhanced stability and prodrug cell killing activity. We conclude that TAT has potential for enhancing enzyme prodrug treatment of liver cancers.

• 대한핵의학회지
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• 제38권2호
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• pp.175-179
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• 2004

Molecular nuclear cardiac imaging has included Tc-99m Annexin imaging to visualize myocardial apoptosis, but is now usually associated with gene therapy and cell-based therapy. Cardiac gene therapy was not successful so far but cardiac reporter gene imaging was made possible using HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase) and F-18 FHBG (fluoro-hydroxymethylbutyl guanine) or I-124 FIAU (fluoro-deoxyiodo-arabino-furanosyluracil). Gene delivery was performed by needic injection with or without catheter guidance. Tk expression did not last longer than 2 weeks in myocardium. Cell-based therapy of ischemic heart or failing heart looks promising, but biodistribution and differentiation of transplanted cells are not known. Reporter genes can be transfected to the stem/progenitor cells and cells containing these genes can be transplanted to the recipients using catheter-based purging or injection. Repeated imaging should be available and if promoter are varied to let express reporter transgenes, cellular (trans)differentiation can be studied. NIS (sodium iodide symporter) or D2R receptor genes are promising in this aspect.

• BMB Reports
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• 제55권12호
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• pp.615-620
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• 2022

The murine leukemia virus-based semi-retroviral replicating vectors (MuLV-based sRRV) had been developed to improve safety and transgene capacity for cancer gene therapy. However, despite the apparent advantages of the sRRV, improvements in the in vivo transduction efficiency are still required to deliver therapeutic genes efficiently for clinical use. In this study, we established a gibbon ape leukemia virus (GaLV) envelope-pseudotyped semi-replication-competent retrovirus vector system (spRRV) which is composed of two transcomplementing replication-defective retroviral vectors termed MuLV-Gag-Pol and GaLV-Env. We found that the spRRV shows considerable improvement in efficiencies of gene transfer and spreading in both human glioblastoma cells and pre-established human glioblastoma mouse model compared with an sRRV system. When treated with ganciclovir after intratumoral injection of each vector system into pre-established U-87 MG glioblastomas, the group of mice injected with spRRV expressing the herpes simplex virus type 1-thymidine kinase (HSV1-tk) gene showed a survival rate of 100% for more than 150 days, but all control groups of mice (HSV1-tk/PBS-treated and GFP/GCV-treated groups) died within 45 days after tumor injection. In conclusion, these findings sug-gest that intratumoral delivery of the HSV1-tk gene by the spRRV system is worthy of development in clinical trials for the treatment of malignant solid tumors.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제11권2호
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• pp.234-241
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• 2001

The C-terminal 393 bp region of the human interleukin-16 (IL-16) gene was cloned and expressed in E. coli along with mammalian cell lines. Recombinant IL-16 expressed from E. coli was 22 kDa on SDS-PAGE and showed 260% of chemoattractant activity at a concentration of $0.1\;{\mu}g/ml$. HeLa, COS, and Neuro-2a cells were transduced by recombinant retrovirus vector pLNC/IL-16/IRES/TK and the intracellular and secreted amounts of IL-16 produced by HeLa/IL-16/TK, COS/IL-16/TK, and Neuro-2a/IL-16/TK cells were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). HeLa/IL-16/TK $(1{\times}10^5)$ and COS/IL-16/TK $(1{\times}10^5)$ cells secreted 36.1 and 13.3 ng of IL-16 for 48 h, respectively. Forty-nine ng and 86.4 ng of IL-16 remained in the cell lysates of HeLa/IL-16/TK and COS/IL-16/TK. Intracellular and secreted amounts of IL-16 from Neuro-2a/IL-16/TK $(5{\times}10^5)$ cells during 24 h cultivation were 50 ng and 3.3 ng, respectively. Also, HeLa and COS cells wee stably transfected with mammalian expression vector pCRIII/IL-16. Both culture media and cell lysates prepared from HeLa/IL-16 cells and COS/IL-16 cells showed chemoattractant activity ranging from 190% to 460% as compared to the control experiment. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase (HSV0tk) gene in pLNC/IL-16/ IRES/TK bicistronic retroviral expression vector was verified by performing a genciclovir (GCV) sensitivity assay. Finally, IL-16 repressed Tat-transactivated human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat (HIV-1 LTR) promoter activity.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제19권9호
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• pp.1070-1076
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• 2009

Telomerase reverse transcriptase (TERT), which prolongs the replicative life span of cells, is highly upregulated in 85-90% of human cancers, whereas most normal somatic tissues in humans express limited levels of the telomerase activity. Therefore, TERT has been a potential target for anticancer therapy. Recently, we described a new approach to human cancer gene therapy, which is based on the group I intron of Tetrahymena thermophila. This ribozyme can specifically mediate RNA replacement of human TERT (hTERT) transcript with a new transcript harboring anticancer activity through a trans-splicing reaction, resulting in selective regression of hTERT-positive cancer cells. However, to validate the therapeutic potential of the ribozyme in animal models, ribozymes targeting inherent transcripts of the animal should be developed. In this study, we developed a Tetrahymena-based trans-splicing ribozyme that can specifically target and replace the mouse TERT (mTERT) RNA. This ribozyme can trigger transgene activity not only also in mTERT-expressing cells but hTERT-positive cancer cells. Importantly, the ribozyme could selectively induce activity of the suicide gene, a herpes simplex virus thymidine kinase gene, in cancer cells expressing the TERT RNA and thereby specifically hamper the survival of these cells when treated with ganciclovir. The mTERT-targeting ribozyme will be useful for evaluation of the RNA replacement approach as a cancer gene therapeutic tool in the mouse model with syngeneic tumors.

• Clinical and Experimental Pediatrics
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• 제46권6호
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• pp.541-547
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• 2003

목 적 : HSVtk 유전자를 암세포에 도입하여 GCV에 대해 선택적으로 감수성을 증가시키는 HSVtk/GCV 유전자 치료에서 방관자 효과는 모든 암세포에 유전자를 도입하지 않고도 치료효과를 얻을 수 있으므로 방관자 효과를 증강시킬 수만 있다면 HSVtk/GCV 유전자 치료의 효과를 극대화시킬 수 있다. HSVtk의 방관자 효과에 관한 기전으로는 간격결합분자들이 주요 역할을 하리라고 알려져 있다. 간격결합분자들은 세포간의 통신을 담당하는 connexin family이며, 주로 Cx43에 관해서는 많이 알려져 왔다. Cx37을 암의 유전자 치료에 이용 가능한 유전자로서의 가능성을 타진하기 위하여 HSVtk/GCV 유전자 치료에 Cx37 유전자를 직접 세포에 발현을 시켜 방관자 효과를 증가시킬 수 있는 새로운 방법의 가능성을 검토하였다. 방 법 : 효과의 검증을 위한 세포주로는 NIH3T3를 사용하였다. HSVtk가 형질도입된 NIH3T3 세포에 GCV의 농도별로 세포사를 관찰하였다. 또한 Cx37의 발현 여부에 따른 세포사멸의 효과를 검토하기 위하여 Cx37 발현 세포주와 비발현 세포주를 서로 다른 비율로 혼합 배양후 나타나는 세포사를 관찰하였다. 최종적으로 Cx37이 세포사멸을 직접적으로 매개하고 있음을 규명하기 위하여 Cx37 발현 표적세포를 크로미움으로 표지화한 후 Cx37 발현 세포주와 비발현 작동세포와 혼합 배양 시 사멸되는 세포로부터 유리되는 크로미움의 양을 측정하였다. 결 과: HSVtk 발현 세포는 GCV 농도에 비례하여 세포가 사멸되었으며 HSVtk/Cx37 동시 발현 세포는 HSVtk만 발현된 세포에 비해 2배 이상의 사멸 효과가 나타났다. 아울러 Cx37에 의해 유도되는 방관자 효과는 표적세포와 작동세포 모두에 Cx37이 발현되는 경우는 세포의 혼합배양 비율에 상관없이 80%에 이르는 세포가 사멸되었다. 특히 작동세포에 Cx37이 없더라도 표적세포에 Cx37이 발현하면 세포사멸은 Cx37이 매개되지 않는 경우에 비교하여 2배 이상의 증가를 보였다. 이러한 결과는 크로미움 유리 실험에서도 동일한 결과가 유도되어 Cx37은 세포사멸을 직접적으로 매개하고 있음이 나타났다. 결 론 : 이상의 결과로부터 HSVtk/GCV 유전자 치료에서 방관자효과를 나타내는 분자의 하나로 Cx37의 기능을 확인하였으며, Cx37은 방관자 효과를 증가시켜 유전자치료의 낮은 유전자 전이율을 극복하고 암의 자살 유전자 치료의 효과를 극대화할 수 있는 분자로 예측된다.

• Clinical and Experimental Pediatrics
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• 제45권3호
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• pp.354-361
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• 2002

목 적: 본 연구에서는 in vitro 및 in vivo에서 HSV-TK 유전자 치료의 bystander 효과 및 기전을 관찰하고, 싸이토카인 유전자의 병합 치료가 bystander 효과를 증폭시킬 수 있는지 조사하여 그 결과를 향후 신경모세포종 치료에 적용하고자 본 연구를 시행하였다. 방 법: A/J 마우스 신경모세포종 모델에서, neuro-2a/TK 세포와 unmodified neuro-2a세포를 여러 비율로 혼합하여 접종한 후 GCV를 투여하여 종양의 크기 변화 및 생존 유무를 관찰하였다. 마우스 신경모 세포종에서 bystander 효과의 기전을 알아보기 위해 neuro-2a/TK 세포를 주입한 마우스의 조직을 절개하여 connexin 43, CD4+ 및 CD8+ 세포 침윤을 관찰 하였다. 10% 및 25% HSV-TK 투여 군에서 neuro-2a/IL-2 세포의 투여가 bystander 효과를 증폭시키는 지 조사하였다. 결 과 : 1) in vitro 및 in vivo에서 bystander 효과는 뚜렷하게 관찰되었다. 2) 마우스 신경모세포종의 면역 조직 화학 염색 검사에서 connexin 43 발현은 관찰되지 않았으나 많은 수의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 침윤이 관찰되었다. 3) 10% 및 25% HSV-TK 투여군의 마우스에서 neuro-2a/IL-2 세포의 투여는 대조군과 비교하여 종양의 성장을 더 억제 시켰다. 결 론: In vitro 및 in vivo에서 HSV-TK/GCV 유전자 치료의 bystander 효과는 뚜렷하였으며, 그 기전으로 면역 세포가 중요한 역할을 할 것으로 추측된다. 그리고 bystander 효과는 IL-2 투여에 의해 증폭됨을 확인하였다. 이는 향후 신경모세포종의 수술 후 잔존암 치료에 HSV-TK/GCV 유전자 치료가 이용 가능할 것으로 생각된다.

• Bulletin of the Korean Chemical Society
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• 제28권12호
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• pp.2449-2453
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• 2007

L-[18F]FMAU ([18F]1b) was prepared from the precursor 2-O-[(trifluoromethyl)-sulfonyl]-1,3,5-tri-Obenzoyl- α-L-ribofuranose, by coupling the radioactive fluoro-sugar with the corresponding silylated thymine in 4 steps. The final products, including the α and β anomers, were purified using reverse phase HPLC with an appropriate solvent (5% CH3CN/H2O) at a flow rate of 3.0 mL/min. The total elapsed time of synthesis was about 180-200 min from EOB. The α/β anomeric ratio of the compounds was about 1:9, and the radiochemical purity of the product (β-form) was >98% with decay-corrected yields of 25-35%. All radioactive samples were confirmed using co-injection with pure non-radioactive analogues in every step. In the cellular uptake in vitro test of herpes simplex virus-thymidine kinase (HSV1-TK) gene expressed cells, the percent uptake of injected dose (%ID) of L- and D-FMAU was 37.28 and 65.86, respectively after 240 min incubation. However, the relative uptake (MCA-TK/MCA cellular uptake ratio) of L-FMAU was higher than that of D-FMAU (%ID of L-FMAU, 0.36 and D-FMAU, 0.93 after 240 min incubation in MCA cells). This means that L-FMAU will show better specific HSV1-TK gene expressed cell uptake for selective HSV1-TK gene imaging.

• Nuclear Medicine and Molecular Imaging
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• 제40권4호
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• pp.218-227
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• 2006

목적 : 헤르페스 심플렉스 1형 바이러스 티미딘 키나제(Herpes simplex virus type 1 thymidine kinase. HSV1-tk) 유전자는 보고 유전자로서 필요한 조건뿐만 아니라 별도의 치료 유전자를 따로 이입할 필요가 없다는 장점을 가지고 있어 유전자 영상과 치료에서 가장 널리 사용되는 유전자이다. 본 연구에서는 간암세포주에서 HSV1-tk 보고 유전자 발현을 비침습적 PET 영상으로 평가하는데 있어서 $9-(4-[^{18}F]Fluoro-3-hydroxymethylbutyl)$guanine ($[^{18}F]FHBG$)의 유용성을 평가하고자 하였다. 대상 및 방법 : $[^{18}F]FHBG$는 triester로부터 8단계를 거쳐 합성하였다. $[^{18}F]FHBG$는 전구체로 N2-monomethoxytrityl-9-[4-(tosyl)-3-monomethoxytritylmethylbutyl]guanine를 사용하고 kyptofix [2.2.2.]를 이용한 친핵성 반응으로 $120^{\circ}C$에서 20분 동안 반응한 후에 1 N HCl로 보호기를 제거함으로써 합성하였다. HSV1-tk 보고 유전자가 이입되어 있는 세포주인 MCA-tk와 이입되지 않은 MCA 세포주를 이용하여 in vitro 상에서의 $[^{18}F]FHBG$의 섭취 및 방출 실험을 실시하였으며 섭취량과 발현량의 상관성 평가를 위해 세포수 백분율에 따른 섭취실험을 실시하였다. In vivo 상에서의 평가를 위하여 피하 종양 형성 동물모델을 이용하여 microPET생체영상을 획득하였다. 결과: 합성된 $[^{18}F]FHBG$를 역상 HPLC를 사용하여, 머무름 시간 16-18분에서 분리하였다. 반감기를 고려한 방사화학적 수율은 20-25%, 방사화학적 순도는 95% 이상이었으며 비방사능은 55.0 $GBq/{\mu}\;mol$ 이상이었다. HSV1-tk 유전자가 이입된 MCA-tk 세포에서는 특이적인 $[^{18}F]FHBG$의 집적이 발생하였으며 대조군인 MCA에서는 거의 집적이 이루어지지 않았다. 또한, 방출 실험에서 방출 후 1시간 경과까지 86% 이상의 $[^{18}F]FHBG$가 세포내에 잔류하였다. MCA-tk 세포주의 비율이 증가함에 따라 $[^{18}F]FHBG$의 섭취량도 직선적 상관관계($R^2=0.995$)에 따라 증가하여 기질의 섭취량이 유전자 발현량을 잘 반영하고 있음이 확인되었다. MicroPET을 이용한 생체영상에서도 MCA와 MCA-tk 에서 확연한 집적의 차이를 보여주었다. 결론: 간암세포주에서 HSV1-tk 유전자의 발현 정도와 지속성 그리고 위치를 확인하기 위한 비침습적 PET 영상을 위한 기질로서 $[^{18}F]FHBG$는 매우 유용할 것으로 기대된다.