The use of antihemophilic factor IX complex has been associated with a variety of thrombotic complications, the major cause of which was the contamination of thrombogenic proteins such as vitamin K-dependent clotting factors II, VII, and X. In order to produce a commercial factor IX (GreenNine VF) free from thrombogenic potential, industrial-scale production process for high-purity factor IX from human plasma has been developed. The purification process contains cryo-precipitation, DEAE-sephadex A-50 anion-exchange chromatography, DEAE-toyopearl 650M anion-exchange column chromatography, heparin-sepharose 6FF affinity column chromatography, and CM-sepharose FF cation-exchange column chromatography. Also the process includes two viral inactivation and removal procedures, solvent/detergent treatment and nanofiltration using Viresolve NFP filter. The purification yield was 35.4%. The specific activity in the purified concentrate was 190.8 IU/mg which exceeded that in the factor IX complex (FacNine) by a factor of 48. The activities of factor II, VII, and X were not detected in GreenNine VF. SDS-PAGE analysis showed that GreenNine VF had the highest purity in comparison with commercially available high purity factor IX concentrates, Mononine, Octanyne, Berinin HS, and Immunine STIM plus 600. One batch size of the production was 2,400 vials of 250 IU product or 1,200 vials of 500 IU product from 1,600 L cryo-poor plasma.
High-level expression of Thermus caldophilus GK24 alkaline phosphatase (Tca APase) was achieved in Escherichia coli using the pET-based expression plasmids, pEAP1 and pEAP2. In the case of plasmid pEAP2, the signal peptide region of Tca APase was replaced by the PelB leader peptide of expression vector pET-22b(+). Furthermore, the expression level was somewhat higher than that of plasmid pEAPl. A rapid purification procedure of Tca APase overproduced in E. coli was developed which involved heating to denature E. coli proteins followed by HiTrap Heparin HP column chromatography. Optimal temperature and pH and $Mg^{2+}$ dependence of the recombinant Tca APase were similar to those of native enzyme isolated from T. caldophilus GK24.
Kim, Byung-Young;Lee, Tae-Ho;Rha, Eu-Gene;Chung, Young-Ryun;Lee, Chang-Won;Kim, Jae-Won
The Korean Journal of Mycology
/
v.25
no.4
s.83
/
pp.330-339
/
1997
Botrytis cinerea T91-1 has shown to produce at least four different polygalacturonases in a liquid medium containing citrus pectin as a carbon source. One of the enzymes, its molecular weight was estimated as 37 kDa by denatured polyacrylamide gel electrophoresis, was purified by a series of procedures including acetone precipitation, ion exchange, heparin affinity, and reverse phase column chromatographies. By viscometric analysis, the enzyme was revealed as an endo-polygalacturonase. The enzyme activity was inhibited by divalent cations such as $Ca^{2+}$, $Co^{2+}$, and $Cu^{2+}$. Km and Vmax for polygalacturonic acid hydrolysis were 0.33 mg/ml and 28.6 nM/min, respectively. The optimum temperature for enzymatic activity was $55^{\circ}C$ and the enzyme showed optimal pH values between 4.0 and 4.5. The enzyme was stable up to 12 hours in the range of pH 4 to 7 and at the temperature below $30^{\circ}C$. Amino acid sequence from N-terminal up to 6 amino acids determined by Edman degradation showed little homology with polygalacturonases from fungi and plants.
Botrytis cinerea T91-1 has been shown to produce at least four different polygalacturonases into a liquid medium containing citrus pectin, a carbon sousrce. One of the enzymes, which had an apparent molecular weight of 66 kDa estimated by denatured polyacrylamide gel electrophoresis, was purified to electrophoretic homogeneity by a series of procedures including a cetone precipitation, ion exchange, heparin affinity, and reverse phase column chromatographies. The molecular weight of native enzyme was determined to be 64 kDa by gel permeation chromatography indicating the enzyme to be a single polypeptide chain. By viscometric analysis, the enzyme was revealed as exo-polygalacturonase. The enzyme activity was inhibited by divalent cations such as $Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$, and Cu$^{2+}$. Km and Vmax for polygalacturonic acid hydrolysis were 0.33 mg/ml and 28.6 nM/min, respectively. The optimum temperature for enzymatic activity was 5$0^{\circ}C$. And the enzyme showed optimal pH values between 4.0 and 5.0. The enzyme was stable upto 12 hours in the range of pH 3 to 8 and at temperature below 3$0^{\circ}C$.
Kim, Youn-Uck;Kim, Youn-Hwoan;An, Duek -Jun;Kwon, Hyuk-Chu
Journal of Microbiology
/
v.39
no.4
/
pp.314-320
/
2001
Macrophages stimulated by lipopolysaccharide(LPS) from gram negative bacteria undergo activation of a group of immediate early genes including Rantes. The mouse Rantes gene promoter region contains an LPS rsponsive element(LPE) We detected 3 specific bands termed B1, B2 and 3 formed by the interaction of the LPE and proteins found in LPS-stimulated RAW 367.7 cells. An additional band B4 was determined to be an Ap-1 binding protein. The B1 band appears within 1 hour of LPS nuclear extracts from LPS-stimulation, and this protein kinase enhances B1 and formation. The B1 band can be converted to band B2/B3 by adding specific heparin column fraction purified Ser/Thr specific protein phosphatases PP-1 and PP-2A can stimulate the same conversion to about the same extent. Thus, the formation of the LRE sequence binding complex appears to be regulated by Ser/Thr protein kinase and one or more Ser/Thr specific phosphatases. At least four proteins are involved in the trgulation of the LRE-dependent Rants experssion: two binding factors that bind directly to the target sequences. and two factors that control their binding. The future purification and characterization of these binding pro-teins will reveal in detail the mechanism of Rantes gene activation after LPS stimulation.
Purpose: Bone morphogenetic protein-2(BMP-2) has been shown to possess significant osteoinducitve potential. There have been attempts to overcome a limitation of mass production, and economical efficiency of BMP. The aim of this study was to produce recombinant human BMP-2(rhBMP-2) from E. coli in a large scale and evaluate its biological activity. Materials and Methods: The E.coli strain BL21(DE3) was used as a host for rhBMP-2 production. Dimerized rhBMP-2 was purified by affinity chromatography using Heparin column. To determine the physicochemical properties of the rhBMP-2 expressed in E. coli, we examined the HPLC profile and performed Western blot analysis. The effect of the purified rhBMP-2 dimer on osteoblast differentiation was examined by alkaline phosphatase (ALP) activity and representing morphological change using C2C12 cell. Results: E. coli was genetically engineered to produce rhBMP-2 in a non-active aggregated form. We have established a method which involves refolding and purifying a folded rhBMP-2 dimer from non-active aggregates. The purified rhBMP-2 homodimer was characterized by SDS-PAGE as molecular weight of about 28kDa and eluted at 34% acetonitrile, 13.27 min(retention time) in the HPLC profile and detected at Western blot. The purified rhBMP-2 dimer stimulated ALP activity and induced the transformation from myogenic differentiation to osteogenic differentiation. Conclusion: rhBMP-2 was produced in E. coli using genetic engineering. The purified rhBMP-2 dimer stimulated ALP activity and induced the osteogenic differentiation of C2C12 cells.
Kim, Woe-Yeon;Lee, Hoon-Sil;Suh, Sook-Jae;Cho, Moo-Je;Lee, Sang-Yeol;Kim, Jae-Won
Korean Journal of Microbiology
/
v.32
no.2
/
pp.147-154
/
1994
Nuclease was secreted to the environmental media from the Escherichia coli JM107 tranformant harboring the extracellular nuclease gene of Serratia marcescens in the plasmid of pNUC4. Under the growth conditions, the amount of secreted enzyme was increased in parallel with bacterial growth conditions, the amount of secreted enzyme was increased in parallel with bacterial growth. The enzyme was purified using chromatofraphic procedures of Matrex green gel and heparin agarose affinity gel, resulted in 50-fold purification with 15% recovery of the enzyme. The apparent molecular weight of the enzyme was estimated to be 29Kda by sodium dodecylsulfate denaturing gel electrophoresis. Using the purified enzyme, polyclonal antibody was obtained from the rabbit. The specificity of the antibody was confirmed by immunoblotting and immunoprecipitaion. For the investigation of cellular distribution of the enzyme, cells were fractionated into three fractions; cytoplasm, periplasm and extracellular fluid. While more than 80% of the enzymatic activity was detected in the extracellular fluid and periplasm, a little was found in the cytoplasm, indicating that the enzyme was likely to be immediately exported to the membrane for excretion after biosynthesis. These results were confirmed again by immunocytochemistry technique using the antibody.
We screened many species from a wide variety of bacterial genera for a new type II restriction endonuclease. The purification and characterization of SolI from a soil isolate, Streptoverticillium olivoverticillatum are described here. The enzyme turned out to be an isoschizomer of BamHI. It recognized the hexanucleotide sequence of 5'-G$\downarrow$GATCC-3' and cleaved as in dicated by the arrow, generating a 4 base 5' extension. Unlike its isoschizomer, BamHI, the activity was sensitive to dam methylation within the recognition sequence. Following ammonium sulfate fractionation of the crude extract, heparin-agarose and Affi-gel Blue column chromatography were employed to purify the enzyme. SolI required at least 0.2 mM of $MgCl_2$ for the cleavage to occur. The enzyme exhibited its maximal activity in the absence of NaCl, but was inhibited completely in the presence of 120 mM NaCl. The pH and temperature optima for activity were pH 8.6 and $40^{\circ}C$, respectively. The molecular weight of SolI was estimated to be 43,000 Da by Superose-12 gel filtraion chromatography.
Park, Mee-Kyung;Kweon, Mee-Hyang;Cho, Hong-Yon;Yang, Han-Chul
Applied Biological Chemistry
/
v.42
no.2
/
pp.140-146
/
1999
We have isolated two anticoagulant polysaccharides from an acidic extract of Codium fragile. The purification was conducted using three consecutive chromatographies of DEAE-Toyopearl 650C, Sephadex G-100 (G-75), and Sepharose CL-6B by measuring activated partial thromboplastin time (APTT). The two purified anticoagulant polysaccharides, CF-1-VIa-1 and CF-1-VIIa-1, were found to be nearly homogenous on HPLC using a gel permeation column and appeared to have molecular weights of about 80,000 Da and 40,000 Da, respectively. The polysaccharides consisted mainly of arabinose and galactose in a molar ratio of about 2 : 1, and also comprised 12-13% of sulfates at their constituent sugars. CF-1-VIa-1 and CF-1-VIIa-1 inhibited blood coagulation via both the intrinsic and the extrinsic pathways. The polysaccharides unlike heparin showed an inhibitory activity on thrombin when a pure fibrinogen without antithrombin III was used as a substrate. Structural modifications using sulfation and desulfation affected the anticoagulant activities directly, suggesting that the content of sulfate plays an important role in the blood coagulation cascade. The polysaccharides may inhibit some proteases involved in the blood coagulation cascade, judging from the independence of calcium concentrations in their anticoagulant activity.
The fucoidan purified from Korean brown seaweed, Ecklonia stolonifera was characterized on molecular structure and blood anticoagulant activities. Extraction was conducted at $100^{\circ}C$ with water and repeated twice. The crude fucodian was 151.1g out of 20.0 kg of Ecklonia stolonifera. The Fucoidan-1, which was purified from crude fucoidan using calcium chloride and cetyl pyridium chloride (CPC), was 35.2% against crude fucoidan. Fucoidan-5 was obtained approximately 28.1% from Fucoidan-1 through DEAE-Toyopearl 650 M ion-exchange column chromatography and showed one band by cellulose acetate electrophoresis. The molecular weight of Fucoidan-5 was estimated to be about 21,000∼23,000 dalton by Sephacryl S-300 gel filtration chromatography. Fucoidan-5 consists of 35.7% of fucose and 4.3% of galactose and the molar ratio of fucose and sulfate was about one to one. IR spectrum of Fucoidan-5 showed absorption at $1240\;cm^{-1}\;and\;850\;cm^{-1}$ and specific rotation value, $[\alpha]$, was $[\alpha]$. These results suggests that the sulfate maybe bind at $C_{4}$ carbon on ${\alpha}-L-fucose$. Gas chromatograph of methyl alditol acetate revealed that Fucoidan-5 is a fucose containing sulfated polysaccharide with $({\alpha}l-2)\;or\;({\alpha}l-2)$ glycosidic linkage. Anti-thrombin activity of the Fucoidan-5 was estimated as 1.4 time stronger than heparin. From above results, the purification methods using CPC and ion exchange chromatography is effective tools for obtaining highly purified fucoidan from Gompi, Ecklonia stolonifera.
본 웹사이트에 게시된 이메일 주소가 전자우편 수집 프로그램이나
그 밖의 기술적 장치를 이용하여 무단으로 수집되는 것을 거부하며,
이를 위반시 정보통신망법에 의해 형사 처벌됨을 유념하시기 바랍니다.
[게시일 2004년 10월 1일]
이용약관
제 1 장 총칙
제 1 조 (목적)
이 이용약관은 KoreaScience 홈페이지(이하 “당 사이트”)에서 제공하는 인터넷 서비스(이하 '서비스')의 가입조건 및 이용에 관한 제반 사항과 기타 필요한 사항을 구체적으로 규정함을 목적으로 합니다.
제 2 조 (용어의 정의)
① "이용자"라 함은 당 사이트에 접속하여 이 약관에 따라 당 사이트가 제공하는 서비스를 받는 회원 및 비회원을
말합니다.
② "회원"이라 함은 서비스를 이용하기 위하여 당 사이트에 개인정보를 제공하여 아이디(ID)와 비밀번호를 부여
받은 자를 말합니다.
③ "회원 아이디(ID)"라 함은 회원의 식별 및 서비스 이용을 위하여 자신이 선정한 문자 및 숫자의 조합을
말합니다.
④ "비밀번호(패스워드)"라 함은 회원이 자신의 비밀보호를 위하여 선정한 문자 및 숫자의 조합을 말합니다.
제 3 조 (이용약관의 효력 및 변경)
① 이 약관은 당 사이트에 게시하거나 기타의 방법으로 회원에게 공지함으로써 효력이 발생합니다.
② 당 사이트는 이 약관을 개정할 경우에 적용일자 및 개정사유를 명시하여 현행 약관과 함께 당 사이트의
초기화면에 그 적용일자 7일 이전부터 적용일자 전일까지 공지합니다. 다만, 회원에게 불리하게 약관내용을
변경하는 경우에는 최소한 30일 이상의 사전 유예기간을 두고 공지합니다. 이 경우 당 사이트는 개정 전
내용과 개정 후 내용을 명확하게 비교하여 이용자가 알기 쉽도록 표시합니다.
제 4 조(약관 외 준칙)
① 이 약관은 당 사이트가 제공하는 서비스에 관한 이용안내와 함께 적용됩니다.
② 이 약관에 명시되지 아니한 사항은 관계법령의 규정이 적용됩니다.
제 2 장 이용계약의 체결
제 5 조 (이용계약의 성립 등)
① 이용계약은 이용고객이 당 사이트가 정한 약관에 「동의합니다」를 선택하고, 당 사이트가 정한
온라인신청양식을 작성하여 서비스 이용을 신청한 후, 당 사이트가 이를 승낙함으로써 성립합니다.
② 제1항의 승낙은 당 사이트가 제공하는 과학기술정보검색, 맞춤정보, 서지정보 등 다른 서비스의 이용승낙을
포함합니다.
제 6 조 (회원가입)
서비스를 이용하고자 하는 고객은 당 사이트에서 정한 회원가입양식에 개인정보를 기재하여 가입을 하여야 합니다.
제 7 조 (개인정보의 보호 및 사용)
당 사이트는 관계법령이 정하는 바에 따라 회원 등록정보를 포함한 회원의 개인정보를 보호하기 위해 노력합니다. 회원 개인정보의 보호 및 사용에 대해서는 관련법령 및 당 사이트의 개인정보 보호정책이 적용됩니다.
제 8 조 (이용 신청의 승낙과 제한)
① 당 사이트는 제6조의 규정에 의한 이용신청고객에 대하여 서비스 이용을 승낙합니다.
② 당 사이트는 아래사항에 해당하는 경우에 대해서 승낙하지 아니 합니다.
- 이용계약 신청서의 내용을 허위로 기재한 경우
- 기타 규정한 제반사항을 위반하며 신청하는 경우
제 9 조 (회원 ID 부여 및 변경 등)
① 당 사이트는 이용고객에 대하여 약관에 정하는 바에 따라 자신이 선정한 회원 ID를 부여합니다.
② 회원 ID는 원칙적으로 변경이 불가하며 부득이한 사유로 인하여 변경 하고자 하는 경우에는 해당 ID를
해지하고 재가입해야 합니다.
③ 기타 회원 개인정보 관리 및 변경 등에 관한 사항은 서비스별 안내에 정하는 바에 의합니다.
제 3 장 계약 당사자의 의무
제 10 조 (KISTI의 의무)
① 당 사이트는 이용고객이 희망한 서비스 제공 개시일에 특별한 사정이 없는 한 서비스를 이용할 수 있도록
하여야 합니다.
② 당 사이트는 개인정보 보호를 위해 보안시스템을 구축하며 개인정보 보호정책을 공시하고 준수합니다.
③ 당 사이트는 회원으로부터 제기되는 의견이나 불만이 정당하다고 객관적으로 인정될 경우에는 적절한 절차를
거쳐 즉시 처리하여야 합니다. 다만, 즉시 처리가 곤란한 경우는 회원에게 그 사유와 처리일정을 통보하여야
합니다.
제 11 조 (회원의 의무)
① 이용자는 회원가입 신청 또는 회원정보 변경 시 실명으로 모든 사항을 사실에 근거하여 작성하여야 하며,
허위 또는 타인의 정보를 등록할 경우 일체의 권리를 주장할 수 없습니다.
② 당 사이트가 관계법령 및 개인정보 보호정책에 의거하여 그 책임을 지는 경우를 제외하고 회원에게 부여된
ID의 비밀번호 관리소홀, 부정사용에 의하여 발생하는 모든 결과에 대한 책임은 회원에게 있습니다.
③ 회원은 당 사이트 및 제 3자의 지적 재산권을 침해해서는 안 됩니다.
제 4 장 서비스의 이용
제 12 조 (서비스 이용 시간)
① 서비스 이용은 당 사이트의 업무상 또는 기술상 특별한 지장이 없는 한 연중무휴, 1일 24시간 운영을
원칙으로 합니다. 단, 당 사이트는 시스템 정기점검, 증설 및 교체를 위해 당 사이트가 정한 날이나 시간에
서비스를 일시 중단할 수 있으며, 예정되어 있는 작업으로 인한 서비스 일시중단은 당 사이트 홈페이지를
통해 사전에 공지합니다.
② 당 사이트는 서비스를 특정범위로 분할하여 각 범위별로 이용가능시간을 별도로 지정할 수 있습니다. 다만
이 경우 그 내용을 공지합니다.
제 13 조 (홈페이지 저작권)
① NDSL에서 제공하는 모든 저작물의 저작권은 원저작자에게 있으며, KISTI는 복제/배포/전송권을 확보하고
있습니다.
② NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 상업적 및 기타 영리목적으로 복제/배포/전송할 경우 사전에 KISTI의 허락을
받아야 합니다.
③ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 보도, 비평, 교육, 연구 등을 위하여 정당한 범위 안에서 공정한 관행에
합치되게 인용할 수 있습니다.
④ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 무단 복제, 전송, 배포 기타 저작권법에 위반되는 방법으로 이용할 경우
저작권법 제136조에 따라 5년 이하의 징역 또는 5천만 원 이하의 벌금에 처해질 수 있습니다.
제 14 조 (유료서비스)
① 당 사이트 및 협력기관이 정한 유료서비스(원문복사 등)는 별도로 정해진 바에 따르며, 변경사항은 시행 전에
당 사이트 홈페이지를 통하여 회원에게 공지합니다.
② 유료서비스를 이용하려는 회원은 정해진 요금체계에 따라 요금을 납부해야 합니다.
제 5 장 계약 해지 및 이용 제한
제 15 조 (계약 해지)
회원이 이용계약을 해지하고자 하는 때에는 [가입해지] 메뉴를 이용해 직접 해지해야 합니다.
제 16 조 (서비스 이용제한)
① 당 사이트는 회원이 서비스 이용내용에 있어서 본 약관 제 11조 내용을 위반하거나, 다음 각 호에 해당하는
경우 서비스 이용을 제한할 수 있습니다.
- 2년 이상 서비스를 이용한 적이 없는 경우
- 기타 정상적인 서비스 운영에 방해가 될 경우
② 상기 이용제한 규정에 따라 서비스를 이용하는 회원에게 서비스 이용에 대하여 별도 공지 없이 서비스 이용의
일시정지, 이용계약 해지 할 수 있습니다.
제 17 조 (전자우편주소 수집 금지)
회원은 전자우편주소 추출기 등을 이용하여 전자우편주소를 수집 또는 제3자에게 제공할 수 없습니다.
제 6 장 손해배상 및 기타사항
제 18 조 (손해배상)
당 사이트는 무료로 제공되는 서비스와 관련하여 회원에게 어떠한 손해가 발생하더라도 당 사이트가 고의 또는 과실로 인한 손해발생을 제외하고는 이에 대하여 책임을 부담하지 아니합니다.
제 19 조 (관할 법원)
서비스 이용으로 발생한 분쟁에 대해 소송이 제기되는 경우 민사 소송법상의 관할 법원에 제기합니다.
[부 칙]
1. (시행일) 이 약관은 2016년 9월 5일부터 적용되며, 종전 약관은 본 약관으로 대체되며, 개정된 약관의 적용일 이전 가입자도 개정된 약관의 적용을 받습니다.