식용 해조류의 일종인 모자반을 추출, 분획 하여 in vitro에서의 항발암효과를 실험하였다. 모자반을 추출, 분획하여 3종의 암세포주(HepG2, HT-29, HeLa)를 이용하여 암세포 독성 효과를 본 결과, 모자반의 ethylether 분획층(SFMEE)과 ethylacetate분획층(SFMEA)에서 3종의 사용 암세포주인 HepG2, HT29 및 HeLa 모두 아주 높은 cytotoxicity를 보였으며, HT29와 HeLa에서는 mathanol 추출물(SFM)과 hexane 분획층(SFMH)에서도 유의적인 암세포 독성 효과를 나타내었다. 정상세포인 liver세포는 모자반의 모든 용매 분획층에서 암세포 독성효과가 낮게 나타났다. 이상과 같이 3종의 암세포에 대한 독성 실험에서 전반적으로 SFMEE층과 EFMEA층에 월등히 높은 암세포 독성 물질이 존재함을 알 수 있었다. 한편 인체 간암세포주인 HepG2를 이용하여 QR 효소 유도 활성 여부를 측정한 결과 SFMEE층은 아주 낮은 초기 첨가 농도인 25 $\mu\textrm{g}$/mL에서, 대조군에 비해 이미 2.89배의 높은 QR 유도 활성 효과를 보였고, SFMH층은 농도의존적으로 그 효과가 증가하여 최종 농도인 100 $\mu\textrm{g}$/mL에서 2.50배의 QR 유도 활성효과를 나타내었다. 모자반의 DPPH radical 소거능을 실험 하였으며 모자반의 메탄을 추출물의 DPPH 소거능 결과는 대조군인 항산화제인 BHT와 Vit C의 결과와 유사하였다. 본 실험의 결과로 모자반은 메탄올 추출물속에 DPPH소거능을 가진 물질이 존재하고 있으며 이 결과는 모자반의 in vitro 항발암활성을 설명하는데 그 기초배경이 될 수 있다. 본 실험 결과를 종합 검토해 보면 모자반 추출물과 용매별 각 분획 층에서의 암세포 독성 효과는 주로 비극성 분획층에서 높게 나타났으며, QR유도 활성 효과도 비극성 분획층인 SFMEE층과 SFMH층에서 나타났다. 특히 SFMEE층은 적은 농도에서 암세포 독성 효과, QR 유도 활성 효과를 나타내었으며 이 연구결과에 대한 단계적인 물질의 분리 동정이 이루어져 SFMEE층에서의 유용한 생리활성물질 개발이 기대되는 바이다.
연구배경 : 말초혈액 단핵구와 폐포 대식세포가 림프구에 의하여 활성화된 후 탐식된 세포내 결핵균을 제거하는 최종 효과기로 작용하지만 결핵균은 이러한 세포 내에서조차 살아남아 증식한다. 본 연구에서는 인체 감염의 경우와 유사하도록 낮은 감염률(결핵균:포식세포 1:10)을 이용하여 MAC(Mycobacterium avium)과 Mycobaterium tuberculosis $H_{37}Ra$에 대한 단핵구와 폐포 대식세포의 림프구 의존적 결핵균 살해능의 정도를 측정하고자 하였다. 방 법 : 정상인과 폐결핵 환자의 말초혈액 단핵구를 Ficoll gradient 방법을 이용하여 분리하고, 정상인의 폐포 대식세포를 기판지폐포 세척액에서 분리 하여 96well plate에 $1{\times}10^5$ 씩 분주하고 결핵균주 MAC과 $H_{37}Ra$에 낮은 감염률(결핵균:단핵구 1:10)로 감염시켰다. 일부는 비부착세포(림프구)를 림프구:포식세포 10:1 비율로 첨가하여 $37^{\circ}C$, 5% $CO_2$ 배양기에 배양하였다. 1일, 4일, 및 7일째 각각 수확하여 middlebrook 7H10/OADC agar plate에 접종 후 집락이 형성될 때까지 $37^{\circ}C$, 5% $CO_2$ 배양기에 배양하였다. 결핵균의 수는 lysate의 $m{\ell}$(세포수 $10^6$)당 CFU로 표시하였고, 결핵균의 살해능은 log killing ratio[logKR=$log_{10}$(Final CFU/Initial CFU)]로 표시하였다. 배양 1일째 상층액에서 TNF-${\alpha}$, 배양 4일째 상층액에서 ${\gamma}$-IFN을 Elisa kit를 사용하여 측정하였다. 결 과 : 단핵구의 세포내 결핵균 살해능은 정상대조군에 비하여 결핵환자군에서 ${\Delta}logKR$가 MAC -0.4, $H_{37}Ra$ -0.2 정도로 유의하게 증가되어 있었다(p<0.05). 정상대조군에서 폐포 대식세포의 결핵균 살해능은 단핵구에 비하여 ${\Delta}$logKR가 MAC과 $H_{37}Ra$ 모두 -0.2정도로 증가된 경향을 보였다. 단핵구와 폐포 대식세포내 결핵균 살해능은 림프구 의존적으로 림프구 첨가시의 ${\Delta}logKR$는 MAC -0.4, $H_{37}Ra$ -0.5 정도로 포식세포 단독에 비하여 유의하게 증가되었다 (p<0.05). ${\gamma}$-IFN은 말초 단핵구와 폐포 대식세포 단독배양시 분비량이 경미하였으나 림프구 첨가시에는 유의한 분비의 증가를 보였다. 결 론 : 본 연구는 낮은 결핵균 감염률을 이용한 인체 포식세포의 세포내 결핵균 감염 모델이다. 결핵균 살해능은 림프구 의존적이며, 포식세포의 결핵균 탐식 후 7일까지의 배양에서 결핵환자의 단핵구와 PPD 양성 정상인의 폐포 대식세포에 림프구를 첨가한 경우에만 실질적인 균 증식의 제한을 볼 수 있었다.
본 연구에서 우리는 갈색거저리 유충 추출물의 암세포 선택적인 세포독성 활성을 암세포주를 대상으로 하는 in vitro 및 in vivo 실험으로 증명하였다. 먼저 갈색거저리 유충의 에탄올 추출물은 정상세포라 할 수 있는 primary hepatocyte에 대한 독성은 미미하였으나 암세포주들에 대한 세포독성과 함께 다른 정상세포인 primary cardiomyocyte에 대한 독성도 가지고 있었다. 에탄올 추출물을 hexane, butanol, ethyl acetate, 물을 이용하여 liquid-liquid partition으로 추가로 분획, 구성물질들을 분리하였고 이들 분획물 중에서 hexane 분획물은 다양한 암세포들(PC3, 22Rv1, HeLa, PLC/PRF5, HepG2, Hep3B, SK-HEP-1, HCT116, NCI-H460, MDA-MB231, SKOV3)에 대한 독성을 유지하면서 cardiomyocyte에 대한 독성이 상당히 줄어들었다. 0.4 mg/mL 에탄올 추출물이 cardiomyocyte를 대부분 죽이는 독성을 보였으나 동일조건에서 hexane 분획물은 약 20% 정도의 세포독성만을 보여주어 독성이 상당히 감소된 것을 확인하였다. 이렇게 비특이적인 세포독성이 물질분리 및 분획을 함으로써 줄어들 수 있다는 것을 확인하였다. 두 번째로 hexane과 ethyl acetate 분획물들이 아포토시스, 세포괴사, 오토파지와 같은 대표적인 세포죽음 기전들을 활성화시킬 수 있는 것으로 확인하였다. 더불어 hexane 분획물의 세포죽음 유도활성은 현재 임상에서 널리 처방되고 있는 항암물질들과 함께 간암세포주에 처리되었을 때 항암활성을 증대시킬 수 있는 것으로 확인하였다. 이와 같은 실험 결과를 바탕으로 갈색거저리 유충 추출물들이 단독으로 혹은 다른 세포독성 약물들과 함께 항암활성을 가질 수 있음을 확인하였다. 마지막으로 hexane 분획물의 항암활성을 in vivo xenograft 실험쥐 모델에서 확인하였는데, 간암세포주인 SK-HEP-1을 이식한 실험쥐에서 hexane 분획물을 15일간 복강주사 하였을 때 종양의 성장을 뚜렷하게 억제하는 것을 확인하였고, 앞선 정상세포에 대한 제한적인 영향과 일치하게 몸무게의 감소 등 부작용이라 할 수 있는 증상은 확인되지 않았다. 이상의 결과들을 종합하면 갈색거저리 유충 추출물의 항암활성을 in vitro와 in vivo에서 확인할 수 있었으며, 새로운 항암활성을 가지는 물질 발굴을 위해 추가적인 분획과 물질 분석이 필요하다고 사료된다.
플룩사피록사드는 카복사마이드계 살균제로 효소 작용을 억제하여 식물체 내 존재하는 균사의 성장을 막는 역할을 한다. 2012년 미국에서 최초로 사용 등록 되었으며 국내에서는 국외의 기준 요청 및 수입식품의 안전관리를 위해 사과, 배에 잔류허용기준이 고시되었다. 플룩사피록사드는 증기압이 낮아 GC로의 분석이 어렵고, 아마이드기를 가지고 있는 구조적 특징을 이용해 UV 영역 특정파장에서 흡광도를 나타낼 것으로 판단되어 분석을 위한 기기로 HPLC-UVD를 선택하였다. 추출용매로는 추출효율을 비교하고, 각 용매의 장단점을 비교하여 아세토니트릴로 하였고, 2단계의 정제 과정을 통해 간섭물질을 효과적으로 제거하였다. 정제 1단계는 액-액 분배로 증류수, 디클로로메탄, 포화식염수를 이용한 층분리를 통해 극성의 간섭물질을 제거하였고, 정제 2단계는 실리카 카트리지를 이용하여 에틸아세테이트/디클로로메탄 혼합액의 정제효율을 비교하여 디클로로메탄 10 mL와 에틸아세테이트/디클로로메탄(5/95, v/v) 2 mL로 씻어내고 에틸아세테이트/디클로로메탄 혼합액(5/95, v/v) 15 mL로 용출하는 것을 선택하였다. 이 때 본 분석법에 의한 플룩사피록사드의 정량한계는 0.05 mg/kg, 검출한계는 0.01 mg/kg으로 나타났다. 개발한 분석법의 선택성과 정확성을 검증하기 위해 0.05 mg/kg, 0.5 mg/kg의 처리농도로 회수율 실험을 한 결과, 평균 회수율이 80.64~113.96%, 분석오차는 10% 미만으로 나타나 코덱스 가이드라인(CAC/GL 40)에 적합하였다. 또한 본 연구에서 개발한 분석법이 공정분석법으로의 신뢰성을 갖기 위해 LC-MS를 이용하여 재확인 시험을 수행하였으며, 그 결과 382 m/z가 최적화됨을 확인하였다. 따라서 플룩사피록사드의 안전관리를 위해 선택적이고 신뢰성 있는 분석법으로 적극 활용될 것이다.
팽이버섯 재배에 있어 가장 문제되는 병해 중의 하나인 팽이버섯 세균성갈색무늬병(세균성갈반병)의 방제약제를 선발하기 위해 제오라이트입제, 키토산, 목초액, $Ca(OCl)_2$, NaOCl 등 5종의 약제를 공시하여 기내와 버섯재배사에서 시험을 수행한 결과, 목초액과 $Ca(OCl)_2$는 0.5% 농도에서 F. velutipes의 균사생장 억제력은 낮았으나, 병원세균인 P. tolaasii에 대해서는 현저한 생장억제력을 보여 팽이버섯 세균성갈색무늬병의 방제약제로 이용가능성이 있는 것으로 나타났다. 발병율은 무처리구에서 43.8%로 매우 높게 나타났으나, $Ca(OCl)_2$ 0.5% 처리구의 경우 14.6%로 가장 낮은 발병율을 보였고, 목초액 0.5% 처리구 및 $Ca(OCl)_2$ 1.0% 처리구에서 20% 내외, 그리고 목초액 1.0% 처리구에서 26.1%의 매우 낮은 발병율을 보였다. 또한 약제 처리농도의 경우 1.0% 보다는 오히려 0.5%의 저농도에서 억제효과가 높은 것으로 나타났다. 무처리구에 비해 처리구에서 품질이 현저히 향상되었으며, 수량도 30% 정도 증수되었고, 특히 $Ca(OCl)_2$ 1.0% 처리구의 경우 35.6%로 가장 높은 증수효과를 나타냈다. 그러나 발병억제율, 품질, 수량 등 전체적인 처리효과를 볼 때, 목초액보다는 $Ca(OCl)_2$가 상대적으로 더 유효하고, 약제별 사용농도는 $Ca(OCl)_2$$0.5{\sim}1.0%$, 목초액은 0.5%의 농도가 본 병의 억제에 가장 유효한 것으로 나타났다.
아까시나무의 목질부와 현사시나무, 물푸레나무 및 느릅나무의 수피를 채취하여 아세톤-물 혼합용액(7:3, v/v) 으로 추출한 후 hexane, chloroform, ethylacetate 및 수용성으로 분획하고 동결건조하여 분말로 조제한 후 메탄올-물 등의 용리용매로 Sephadex LH-20 칼럼에서 크로마토그래피를 수행하였다. 물푸레나무에서는 aesculitin 및 그 파생물인 fraxetin 등 다량의 쿠마린 화합물과 에스테르화합물을 단리하였으며, 느릅나무로부터 C-7에 xylopyranose와 apiofuranose와 같은 5탄당이 결합된(+)-catechin 배당체 화합물과 procyanidn B-3를 단리하였다. 아까시나무에서는 leucorobinetinidin의 C-4에 ethoxyl 기가 결합된 flavan 유도체 화합물과 robinetin 등의 flavanonol 화합물을 단리하였다. 현사시나무에서는 taxifolin 등의 후라보노이드 화합물과 배당체인 sakuranetin-5-O-glucopyranoside를 단리하였으며 살리신 유도체인 salireposide 등을 단리하였다. 내후성 시험에서는 목재블록에 부후균을 접종하여 배양한 후 중량감소를 측정하는 방법과 목분-agar 배지에 부후균을 접종한 후 균사의 생장 직경을 측정하는 방법을 적용하였다. 아까시나무가 다른 시룓르보다 우수한 활성을 나타내었으며 특히 메탄올 추출머리를 하지 않은 시료가 처리한 시료보다 좋은 균사생장 저해효과를 나타냈다. 항산화 활성 시험에서는 물푸레나무의 에틸아세테이트 분획이 가장 높은 활성을 보였으며, 아까시나무의 에틸아세테이트 분획도 비교적 높은 효과를 나타내었고, 이 두 분획으로부터 단리된 주요 단리화합물에 대해서는 물푸레나무의 aesculetin이 가장 높았으며 아까시나무의 robinetinidin도 비교적 좋은 효과를 나타냈다.)나 틈새시장(niche market) 마케팅 등에 적용 가능하리라 여겨진다.된다.다.산물로 판단되었다.징하며 WLWQ에 적용되는 몇 가지 제약을 관찰하고 이를 일반적인 언어원리로 설명한다. 첫째, XP는 주어로만 해석되는데 그 이유는 XP가 목적어 혹은 부가어 등 다른 기능을 할 경우 생략 부위가 생략의 복원 가능선 원리 (the deletion-up-to recoverability principle)를 위배하기 때문이다. 둘째, WLWQ가 내용 의문문으로만 해석되는데 그 이유는 양의 공리(the maxim of quantity: Grice 1975) 때문이다. 평서문으로 해석될 경우 WP에 들어갈 부분이 XP의 자질의 부분집합에 불과하므로 명제가 아무런 정보제공을 하지 못한다. 반면 의문문 자체는 정보제공을 추구하지 않으므로 앞에서 언급한 양의 공리로부터 자유롭다. 셋째, WLWQ의 XP는 주제어 표지 ‘는/-은’을 취하나 주어표지 ‘가/-이’는 취하지 못한다(XP-는/-은 vs. XP-가/-이). 이는 IP내부 에 비공범주의 존재 여부에 따라 C의 음운형태(PF)가 시성이 정해진다는 가설로 설명하고자 했다. WLWQ에 대한 우리의 논의가 옳다면, 본 논문은 다음과 같은 이론적 함의를 기닌다. 첫째, WLWQ의 존재는 생략에 대한 두 이론 즉 LF 복사 이론과 PF 삭제 이론 중 전자의 입장을 지지한다. 둘째, WP를 XP로부터 복원할 때 부분 자질만 복사된다. 이는 어휘가 통사층위로 들어온 이후에도 어휘 자질들이 완전히 동결되는 것이 아니라 계속 지시될 수 있다는 가설을 지지한다.ance and stress, and high threshold voltage. Besides, sheet resistance and stress value, rms(root mean square) by AFM were observed. On the electrical
목 적 : $IFN{\gamma}$는 다양한 암세포에서 $TNF{\alpha}$와 FAS/CD95 수용체 발현을 증가시키거나 caspase나 Bcl-2 가족의 활성화를 조절하여 $TNF{\alpha}$와 FAS/FASL 유도성 세포고사를 촉진한다. 신경모세포종에서 $IFN{\gamma}$와 $TNF{\alpha}$는 협동적으로 세포 분화를 유도하거나 성장 억제를 일으킨다. 또한 일부 신경모세포종에서 자연적인 FAS 수용체 발현에도 불구하고 그 리간드 자극에 의한 세포고사 유도에는 실패하였고 $IFN{\gamma}$ 투여로 이를 극복할 수 있음이 보고되었다. 본 연구에서는 $IFN{\gamma}$가 $TNF{\alpha}$나 길항적 FAS/CD95 항체 유도성 세포고사를 촉진할 수 있는지 여부를 다양한 항암제에 대한 내성을 가지고 있는 신경모세포종 세포주를 이용하여 알아보았다. 방 법 : CHLA-15, CHLA-90와 LA-N-2 신경모세포종 세포주를 IMDM 배지로 배양하였고 유전자 재조합 $IFN{\gamma}$, $TNF{\alpha}$, 길항적 FAS/CD95 항체(CH-11)를 투여하였다. 세포 생존율은 형광기질인 calcein-AM을 이용한 DIMSCAN을 통하여 측정하였고, 세포고사 정도는 Annexin V-PE와 7-ADD염색을 이용한 유식세포 분석기를 통하여 분석하였고 pancaspase and caspase-8 억제 실험을 통하여 확인하였다. TNF와 FAS/CD95 수용체 표현은 각각에 대한 단클론 항체와 PE가 결합된 이차 항체를 이용하여 유식세포 분석기로 알아보았다. 결 과 : $IFN{\gamma}$ 또는 $TNF{\alpha}$ 단독 투여로는 모든 세포주에서 의의있는 세포 독성을 유도하지 못 했으나 $IFN{\gamma}$와 $TNF{\alpha}$을 병행 투여시에는 CHLA-15과 CHLA-90 세포주에서 의의있는 세포 생존율 감소와 공통 capase경로를 통한 세포고사를 협동적으로 촉진하였다. 또한 길항적 FAS/CD95 항체 단독 투여 시에는 모든 세포주에서 세포 생존율의 변화가 없었으나 $IFN{\gamma}$ 전 처치 후 투여 시에는 CHLA-90 세포주에서 현저한 세포 생존율 변화 및 세포고사를 유도하였다. $INF{\gamma}$ 치료 후 TNFRI와 FASR의 발현이 모든 세포주에서 현저히 증가하였는데 이는 일부 감수성이 있는 신경모세포종에서 $INF{\gamma}$에 의한 $TNF{\alpha}$와 FAS/CD95수용체 유도성 세포고사 촉진의 한 기전이 될 것으로 사료된다. 결 론: 일부 신경모세포종에서 $IFN{\gamma}$가 $TNF{\alpha}$와 길항적 FAS/CD95 항체 유도성 세포고사를 감작화 시켰으며 이는 수용체 발현의 증가와 동반되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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