• Clinical and Experimental Pediatrics
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• 제50권10호
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• pp.1011-1017
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• 2007

목 적 : 쥐의 섬유아세포인 NIH 3T3와 eGFP 유전자를 표지로 하는 레트로바이러스 벡터를 이용하여 유전자 전달효율을 향상시킬 수 있는 조건들을 살펴보고자 하였다. 방 법 : 표적세포에 대한 벡터의 비율과(1:1-1:8) 전달감염 횟수를 변화시켰을 때(1회, 2회), 양이온 복합체인 polybrene($4{\mu}g/mL$)을 첨가하였을 때 유전자 전달효율의 변화를 분석하였다. eGFP 유전자의 발현을 확인하기 위하여 형광 현미경 하에서 녹색빛을 내는 세포들을 관찰하고 FACscan으로 eGFP 양성세포의 비율을 측정하였다. 결 과 : 유전자 전달효율은 벡터와 표적세포의 비율 1:1에서 7%, 1:4에서 38%로 표적세포에 대한 레트로바이러스 벡터의 비율이 높을수록 상승하였지만 비율 1:4와 1:8사이에서는 차이가 없었다. 전달감염을 두 번 시행하는 것이 벡터와 표적세포의 비율 1:4까지는 유전자 전달효율에 영향을 미치지 않았지만 비율 1:8에서는 유전자 전달효율을 증가시켰다. 전달감염 후 eGFP 유전자의 발현은 3회 계대배양까지 약 3배 가량 증가하였지만 이후에는 감소하였는데 이와 같은 감소 정도는 전달감염을 한 번 시행한 경우가 두 번 시행한 경우보다 더 커서 전달감염을 반복하는 것이 유전자 전달효율의 증가효과보다는 주입된 유전자의 지속발현에 더 영향을 미치는 것으로 판단되었다. Polybrene을 첨가하였을 때 유전자 전달효율은 5.8%에서 38.8%로 대폭 상승하였으며 독성반응은 관찰되지 않았다. 배양접시의 크기에 따른 유전자 전달효율을 비교하였을 때 NIH 3T3세포의 증식정도는 6-well plate가 더 컸지만 eGFP 양성세포의 비율은 24-well plate에서 더 높았다. 결 론 : 이번 연구결과를 기초로 삼아 유전자 치료의 연구를 발전시키고 특히 전달된 유전자의 안정적인 발현과 바이러스 벡터들의 독성 등에 대하여 향후 연구의 초점을 두어야 할 것으로 생각된다.

• BMB Reports
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• 제53권10호
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• pp.521-526
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• 2020

Endogenous retroviruses (ERVs) are retrotransposons present in various metazoan genomes and have been implicated in metazoan evolution as well as in nematodes and humans. The long terminal repeat (LTR) retrotransposons contain several regulatory sequences including promoters and enhancers that regulate endogenous gene expression and thereby control organismal development and response to environmental change. ERVs including the LTR retrotransposons constitute 8% of the human genome and less than 0.6% of the Caenorhabditis elegans (C. elegans) genome, a nematode genetic model system. To investigate the evolutionarily conserved mechanism behind the transcriptional activity of retrotransposons, we generated a transgenic worm model driving green fluorescent protein (GFP) expression using Human endogenous retroviruses (HERV)-K LTR as a promoter. The promoter activity of HERV-K LTR was robust and fluorescence was observed in various tissues throughout the developmental process. Interestingly, persistent GFP expression was specifically detected in the adult vulva muscle. Using deletion constructs, we found that the region from positions 675 to 868 containing the TATA box was necessary for promoter activity driving gene expression in the vulva. Interestingly, we found that the promoter activity of the LTR was dependent on che-1 transcription factor, a sensory neuron driver, and lin-15b, a negative regulator of RNAi and germline gene expression. These results suggest evolutionary conservation of the LTR retrotransposon activity in transcriptional regulation as well as the possibility of che-1 function in non-neuronal tissues.

• 생명과학회지
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• 제16권3호
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• pp.540-545
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• 2006

T-DNA 매개 형질전환은 삽입 돌연변이를 가지는 형질전환 식물체를 만들기 위한 유용한 방법이다. 애기장대의 shoot 발달 과정에서 중요한 역할을 하는 유전자를 확인하기 위해, 프로모터 trap 식물체 라인을 제작하고 분석하였다. 이를 위해 효율적인 프로모터 trap 백터인 pFGL561을 제작하였다. pFGL561은 basta 저항성 유전자, multiple splicing donor acceptor 서열들, 그리고 프로모터가 없는 GFP 리포터 유전자를 포함하고 있다. Agrobacterium 균주인 GV3101에 pFGL561을 도입하고, 이를 매개로 하여 300개의 $T_1$ 프로모터 trap 식물체를 제작하였고, 이들 식물체에서 GFP 발현을 조사하였다. $T_1$ 식물체에서 GFP 발현 비율은 26.7%로 매우 높았고, 이러한 발현은 $T_2$ 식물체에서도 재확인되었다. 한편, 식물의 shoot 발달에 관여하는 주요 유전자를 동정하기 위해서, shoot에서 GFP발현을 보인 19개 $T_1$ 식물체에서 유래한 $T_2$ 식물체를 대상으로 표현형을 조사한 결과, 비정상적인 shoot발달을 보이는 6개 $T_1$ 라인을 확인하였다. 이들 식물체는 shoot발달의 조절 기작 분석에 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

• 한국가금학회지
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• 제32권4호
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• pp.225-229
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• 2005

현재 가장 활발하게 진행되고 있는 형질전환 자 생산 연구방법은 배반엽단계 수정란에 농축한 virus를 주입하여 모자이크 형태의 $G_0$ 형질 전환체를 생산하고 이들을 이용하여 $G_1$ 형질전환 후대를 생산하는 방법이 가장 보편적으로 이용되고 있다. 상기의 연구방법은 완전한 형질 전환체를 획득하기 위해서는 수천수의 $G_1$을 생산하고 각각 유전분석을 수행하는 문제점을 가지고 있다. 이러한 문제점을 개선하고자 다음의 연구를 계획하고 수행하였다. 20nL의 농축된 GFP retrovirus를 1세포기 수정란에 주입하고, 주입한 유전자의 발현율과 수정란의 생존율을 배양 4일차 수정란에서 GFP의 발현과 배자의 생존 여부로 판정하였다. 연구결과는 배양 4일차 수정란의 생존율은 기존의 naked DNA 미세주입방법에 비해 다소 낮은 것으로 나타났으나 유의성은 없었다. 1세포기 수정란은 배반엽 단계 수정란과 달리 주입한virus의 유전자를 발현하지 않는 것으로 관찰되었다. 연구결과는 배반엽단계 수정란에 virus 미세주입 방법이 형질전환 닭 생산에 가장 효율적인 방법임 보여주고 있다.

• 한국어병학회지
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• 제22권3호
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• pp.375-382
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• 2009

목적 유전자를 숙주 세포의 게놈에 삽입하거나 발현하는데 있어서, retrovirus 매개의 유전자 전달 시스템을 사용하게 되면, 복잡하고 힘든 절차를 거치게 된다. 본 연구에서는 목적 유전자의 BF-2 세포 게놈 내 삽입을 하기 위해, UV로 불활화한 어류 레트로바이러스인 SnRV를 사용한 간단한 방법에 대해 조사하였다. 우선, BF-2 세포를 사용한 transfection을 위해 Lipofectamine 2000과 Transome을 사용하여 최적 조건을 결정하였다. 0.5 $\mu\ell$ Lipofectamine 2000을 사용한 경우 0.5, 1 그리고 2 $\mu{g}$ DNA 사용에 대해 33.8, 40.6 그리고 40.2%의 transfection 효율을 보인 동시에 최소 80 % 이상의 높은 세포 생존율을 나타낸 반면, Transome을 사용한 transfection 효율은 모두 5% 이하였다. UV 처리 시간에 있어서는 5분간의 UV 처리로 SnRV의 감염성이 불활성화되는 것을 확인하였다. 다음으로 GFP 유전자의 양측에 SnRV에서 유래된 LTR 서열을 접하고 있는 cassette를 구축한 뒤 BF-2 세포에 transfection 하고, cassette 유전자의 삽입과 발현을 위해 UV로 불활화한 SnRV를 처리하였다. 그 결과 UV로 불활화한 SnRV를 1회 처리 또는 SnRV 무처리 BF-2 세포에서는 형광이 관찰되지 않았던 반면, 3회와 5회 처리한 BF-2 세포에서 형광발현이 확인되었다. 이러한 결과로, GFP 유전자가 불활화한 SnRV를 이용하여 BF-2 세포 게놈에 삽입되는 것을 확인하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제29권1호
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• pp.160-170
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• 2019

The lactic acid bacteria species Lactobacillus plantarum (L. plantarum) has been used extensively for vaccine delivery. Considering to the critical role of dendritic cells in stimulating host immune response, in this study, we constructed a novel CD11c-targeting L. plantarum strain with surface-displayed variable fragments of anti-CD11c, single-chain antibody (scFv-CD11c). The newly designed L. plantarum strain, named 409-aCD11c, could adhere and invade more efficiently to bone marrow-derived DCs (BMDCs) in vitro due to the specific interaction between scFv-CD11c and CD11c located on the surface of BMDCs. After incubation with BMDCs, the 409-aCD11c strain harboring a eukaryotic vector pValac-GFP could lead to more efficient expression of GFP compared with wild-type strains shown by flow cytometry analysis, indicating the enhanced translocation of pValac-GFP from L. plantarum to BMDCs. Similar results were also observed in an in vivo study, which showed that oral administration resulted in efficient expression of GFP in both Peyer's patches (PP) and mesenteric lymph nodes (MLNs) within 7 days after the last administration. In addition, the CD11c-targeting strain significantly promoted the differentiation and maturation of DCs, the differentiation of $IL-4^+$ and $IL-17A^+$ T helper (Th) cells in MLNs, as well as production of $B220^+$ $IgA^+$ B cells in the PP. In conclusion, this study developed a novel DC-targeting L. plantarum strain which could increase the ability to deliver eukaryotic expression plasmid to host cells, indicating a promising approach for vaccine study.

• 한국가축번식학회지
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• 제26권4호
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• pp.347-351
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• 2002

Transgenes in HSY-TK gene driven by the lck promoter was tested for the expression in immune cells (Jurkat cells) to apply xenotransplantation of human cells into transgenic animals for the potential use of the proliferation or differentiation of human stem cells in the large animal such as an pig. Also, lck-CFP gene was used for transfection experiment into Jurkat cell to confirm the proper regulation of lck promoter for transgene expression in the T cells. Transfection of lck-GFP gene into Jurkat ceils induced CFP expression in transfected cells. The expression of Ick-TK and Ick-CFP genes was confirmed by RT-PCR using RNAs extracted from Jurkat cells, When Jurkat cells transfected with TK and CFP genes were selected against G418 or gancyclovir treatments, Jurkat cells transfected with TK gene were not proliferated in G4i8 and gancyclovir medium while intact cells or cells transfected with CFP gene could grow in gancyclovir medium. However, Jurkat cells transfected with TK or GFP gene were proliferated in G418 medium probably due to Neo$^{r}$ gene in the vector. Gancyclovir treatment destroyed Jurkat cells expressing TK gene indicating that T-cells expressing TK gene can be selectively eliminated by TK gene expression driven by lck promoter.

• 한국어업기술학회:학술대회논문집
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• 한국어업기술학회 2002년도 추계 수산관련학회 공동학술대회발표요지집
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• pp.183-184
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• 2002

The use of transgenic fish has so far been chiefly limited by the lack of predictable, strong, tissue specific, and position-independent expression of transgenes. For genetic analysis, expression of a marker transgene, easily screenable in the living fish, could facilitate studies of gene targeting, insertional mutagenesis, lineage, and mutational analysis. (omitted)

• 한국미생물학회:학술대회논문집
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• 한국미생물학회 2005년도 International Meeting of the Microbiological Society of Korea
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• pp.224.3-224
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• 2005

• 한국동물학회:학술대회논문집
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• 한국동물학회 1998년도 한국생물과학협회 학술발표대회
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• pp.224.2-224
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• 1998

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