회분식 배양을 통해 탄소원으로 초기 glucose 농도를 5g/$\ell$, lOg/$\ell$, 20g/$\ell$, 30g/$\ell$ 로 변화시키고, 초기 glucose 농도 20g/$\ell$ 에 저해제의 초기 acetIcacid 농도를 19/$\ell$, 2g/$\ell$, 3g/$\ell$, 4g/$\ell$, 5g/$\ell$ 로 변화시키면서 Bacillus amyloliquefacieηs 23350 균주를 이용하여 최적의 세포성장과 생성물 생산을 얻기 위한 배양을 시도하였다. 최대 건조세포밀도는 초기 glucose 농도가 증가할수록 증가하였고, 저해제로 acetic acid를 첨가하면 세포의 성장이 감소하였다. 탄소원 중 최대 $\alpha$-amylase의 생산은 초기 glucose 농도 lOgje 일 때 225unit/ml이었으며, 배양 기질 중 초기 acetic acid 농도가 2g/$\ell$ 일 때가 376unit/ml이었고, 최대 비세포성장속도와 최대 $\alpha$-amylase 의 비생성속도는 초기 glucose 농도가 109/E 일 때 $0.1239(hr^{-1})$ 과 2.34930unit/mg-hr로 최적이었다. 최적의 $\alpha$-amylase 생산 및 비생성속도를 얻기 위해서는 저해제로서 초기 acetic acid 농도를 2-4g/$\ell$ 정도 첨가하여 배양을 행하여야 한다.
복분자 진액, 분말, 향(농축액)의 첨가량을 달리하여 최적의 복분자초콜릿을 개발하고자 하였다. 복분자초콜릿의 당도는 복분자 진액 함량이 감소할수록 증가하는 경향을 보였을 뿐 시료간의 유의적인 차이는 없었다. 경도는 복분자 진액 30 g, 분말 10 g, 향 0.3 g을 첨가한 시료 C가 가장 높았고 복분자 진액 60 g, 향 0.3 g 첨가한 시료 A가 가장 낮은 경도를 보여 복분자 진액 첨가함량이 낮을수록, 복분자 분말 첨가함량이 높을수록 증가하는 경향을 나타냈다. 색도는 복분자 진액 첨가량이 증가하고 복분자 분말 양이 감소할수록 명도가 증가하는 반면, 복분자 분말 함량이 증가할수록 적색도와 황색도가 증가하는 경향을 보이면서 진한 보랏빛으로 변하였다. 관능평가 결과 복분자 진액 30 g, 복분자 분말 5 g, 복분자 향 0.3 g을 첨가하여 제조한 시료 D가 종합적 기호도에서 가장 높은 점수를 나타냈고$(3.87{\pm}0.99)$, 향 관능평가에서는 복분자 농축액(향) 함유비율이 높은 시료 D가 유의적으로 높은 점수를 보였다. 또한 색도의 경우 시료 D가 복분자 고유의 색이 잘 나타나 가장 높은 점수를 나타냈고 적색도가 낮고 명도가 높은 연보라색의 시료 A(복분자 진액 60 g, 분말 무첨가)가 유의적으로 낮은 선호도를 보였다. 경도에서는 수분함량이 높고, 낮은 경도를 보이는 시료 A의 선호도가 높았다. 이상과 같이 분석결과를 종합하여 보면 다크초콜릿 530 g, 화이트초콜릿 300 g, 휘핑크림 130 g, 카카오버터 40 g, 복분자 진액 30 g, 복분자 분말 5 g, 복분자 향 0.3 g을 첨가한 시료 D가 복분자 고유의 향미와 색, 부드러운 질감을 느낄 수 있어 복분자초콜릿의 최적 레시피로써 적합하다고 사료된다.
액상청국장의 추출공정별 청국장 추출물의 특성 비교 및 청국장의 최적 추출조건을 설정하고자 하였다. 용매로 물을 사용하여 추출한 액상청국장을 각각 마이크로웨이브 파워별(30, 60, 90, 120 및 150 W), 시간별(1, 5, 9, 13 및 17분)로 추출한 후 생리활성 실험을 수행하였을 때, 수율, 전자공여능, 아질산염 소거능, tyrosinase 저해작용, SOD 유사 활성 등의 생리활성 측정을 통해 추출 최적조건을 찾아내었다. 반응표면분석법을 이용하여 모니터링 한 결과, 액상청국장은 수율, tyrosinase 저해작용, SOD 유사활성이 일치하는 범위로 마이크로웨이브 파워 $55{\sim}75$ W, 시료에 대한 용매비 $2{\sim}5$ g/mL, 추출시간 $3.5{\sim}15$분으로 확인되었다. 예측결과에 의한 최적조건을 확인하기 위하여 예측된 최적조건 범위 내에서 임의의 조건을 대입하여 이화학적 특성을 예측해본 결과 액상 청국장에 대한 임의의 조건으로 시료에 대한 파워 60 W, 용매비 3.5 g/mL, 추출시간 13분을 설정한 후 액상 청국장에 대한 각각의 회귀식에 대입하여 얻은 예측된 최적값은 수율 24.99%, 전자공여능 75.42%, 아질산염 소거능 70.12%, tyrosinase 저해작용 15.69%, SOD 유사활성 36.16%로 실험값과 예측값 간의 유의적인 차이가 나타나지 않았다.
Methylobacterium organophilum을 사용하여 메탄올로부터 세포외 고점도 다당류, 메틸란의 생산을 특정 배양조건에서 수행하였다. C/N 비율이 미치는 영향을 살펴본 결과 균체의 비성장속도는 C/N 비율에 대하여 큰 차이가 없었고, 단위 균체당 메틸란 생산수율은 C/N 비율 약 30부근에서 최적이었다. 여러 가지 금속염 중에서 Mn$^{++}$과 Fe$^{++}$ 이온이 결핍하면 메틸란의 생산이 현저히 저해됨을 보였다. 균체 농도와 메틸란 생산은 pH는 7근처에서 최적을 나타내었다. 균체 성장의 최적온도는 37$^{\circ}C$이었으나 메틸란 생산의 최적 온도는 3$0^{\circ}C$이었다. 메탄을 농도가 증가할수록 비성장속도가 감소하였고, 4% 이상의 농도에서는 균체 성장이 완전히 저해되었다. 메틸란 생산을 위한 최적 메탄올 농도는 초기농도로 0.5%(v/v)이었고 그 이상의 농도에서는 메틸란 생산이 급격히 감소하였다. 메탄올의 독성과저해를 극복하기 위하여 최적 배양조건에서 메탄올의 유가식 배양을 수행하여 최종 균체 농도와 최종 메틸란 농도가 각각 12.4 g/l 및 8.7 g/l이었다.
D-Tagatose의 생산 가능성이 있는 미국 종균협회(ATCC)와 한국 유전자은행(KCTC)에서 구입한 균주 35 종류를 사용하여 D-galactose로부터 D-tagatose의 생산을 조사하였다. 여러 균주 중에 발효시간이 짧고 D-tagatose의 생산량이 높은 Enterobactor agglomerans ATCC 27987을 D-tagatose 생산 균주로 선정하였다. 선정된 균을 사용하여 D-tagatose의 생산에 영향을 주는 배양 조건을 최적화 하였다. 여러 가지 탄소원 중에서 D-galactose가 D-tagatose의 생산량이 가장 높게 나타났고 그 농도를 달리하였을 때 D-galactose의 농도가 증가할수록 D-tagatose의 생산량과 균체농도가 증가하였다. 20 g/l의 D-galactose 배지에서 여러 가지 질소원이 D-tagatose의 생산에 미치는 영향을 살펴본 결과 D-tagatose의 생산량은 유기 질소원의 경우 yeast extract가 가장 높았고 무기 질소원의 경우 (NH$_4$)$_2$SO$_4$가 높게 나타났다. D-Tagatose의 생산량이 가장 높게 나타난 질소원인 yeast extract를 선택하여 농도별 실험을 수행하여 최적 yeast extract의 농도를 5.0 g/l로 결정하였다. (NH$_4$)$_2$SO$_4$를 yeast extract 5.0 g/l가 함유된 배지에 농도별로 첨가하여 2.0 g/l에서 최대 D-tagatose의 생산량을 얻었다. 또한, 무기염의 영향을 조사하여 KH$_2$PO$_4$ 5.0 g/l, $K_2$HPO 5.0 g/l, MgSO$_4$.7$H_2O$ 5.0 mg/l의 최적 D-tagatose 생산 조건을 결정하였다. 배지최적화를 통하여 최적 배지로 D-galactose 20 g/l, yeast extract 5.0 g/l, (NH$_4$)$_2$SO$_4$ 2.0 g/l, KH$_2$PO$_4$ 5.0 g/l, $K_2$HPO$_4$ 5.0 g/l, MgSO$_4$.7$H_2O$ 5 mg/l를 선정하였다. 최적 배지에서 배양 환경이 D-tagatose의 생산에 미치는 영향을 조사하여 초기 pH 6.0, 배양 온도 3$0^{\circ}C$, 교반속도 150 rpm의 최적 배양 조건을 결정하였고 이 조건에서 배양시간 24시간에 D-galactose 20 g/l로부터 D-tagatose의 0.41 g/l를 얻을 수 있었다.
수용액 시료 중에 존재하는 농약 7종을 속빈 섬유(hollow fiber)를 이용한 미량 추출법으로 농약을 추출/농축 한 후 GC/MS로 동시 분석하는 방법을 최적화 하였다. 실험 인자들을 변화시키면서 농약 추출 및 농축을 위한 최적 조건으로써 유기 용매는 톨루엔을 선정하였고 시료의 교반 속도로는 1200 rpm이 최적의 추출효율을 나타내었다. 염석효과를 위해서 염화소듐의 양을 5~25%까지 첨가하여 이온세기에 의한 추출량을 비교한 결과는 15%에서 최적 추출률을 나타내었고, 최적의 추출을 위한 평형시간은 15분임을 확인할 수 있었다. pH에 대한 영향을 검토한 결과 pH 5에서 최대 추출효율을 나타내었다. $5{\sim}50{\mu}g/L$의 범위의 농도 내에서 검정곡선을 작성한 결과 7종의 농약 모두 회귀 계수(Coefficient of Regression, $R^2$)는 0.995 이상으로 좋은 직선성을 나타내었다. 검출 한계(Limits of detection, LOD)는 $0.37{\sim}1.23{\mu}g/L$, 정량 한계(Limits of Quantification, LOQ)는 $1.19{\sim}3.91{\mu}g/L$ 범위의 값을 얻을 수 있었다.
Ascorbic acid로부터 $2-O-{\alpha}-D-glucopyranosyl-L-ascorbic$ acid(ascorbic acid-2-glucoside, AA-2G)를 생산하기 위하여, transglucosylation 활성을 가지는 시금치 종자의 ${\alpha}-glucosidase$를 효소원으로 이용하였다. 시금치 종자로 사용한 Spinachia oleracea L. WooSung의 조효소액의 ${\alpha}-glucosidase$ 활성은 발아 후 3일 째에 가장 높게 나타났으며, AA-2G의 생산은 2일 키운 시금치의 조효소액을 이용하였을 때, 생산량이 1.053 mM로 가장 높았다. 조효소액을 이용한 AA-2G 생산에 있어서 glucose 공여체로는 maltose가 가장 좋았으며, maltose와 ascorbic acid의 최적 농도는 각각 225 mM과 175 mM이었다. ${\alpha}-glucosidase$는 60 unit를 사용했을 때 생산량이 가장 좋았다. 효과적인 반응완충용액은 sodium acetate 완충액이었으며, 최적 농도는 175 mM이었다. 최적 pH및 반응온도는 각각 5.0과 $65^{\circ}C$였고, 최적 반응조건 하에서 50분 반응 후에 ascorbic acid로부터 2.30 mM의 AA-2G가 생산되었다.
곰팡이인 Mortierella alpina DSA-12를 이용한 arachidonic acid의 생산을 위한 유기질소원의 선정과 배양 조건의 결정에 연구를 수행하였다. Corn steep powder (CSP)를 원료의 가격과 arachidonic acid의 생산을 기준으로 유기질소원으로 선정하였다. 탄소원으로 glucose와 질소원으로 CSP를 사용한 경우에 최적의 C/N ratio는 15-17 범위이다. Arachidonic acid의 생산을 위한 최적의 배양조건은 $25^{\circ}C$에서 500 rpm의 교반과 0.5 vvm의 통기이며, 이 때 50 g/L의 glucose와 18 g/L의 CSP로부터 21.8 g/L의 균사체량에 10.2 g/L의 총 지질을 얻을 수 있었으며, arachidonic acid의 농도는 3.70 g/L이었다. 500 L의 발효조에서 0.5 vvm과 200 rpm의 교반으로 실험을 수행한 결과 19.8 g/L의 균사체량과 9.1 g/L의 총 지질 및 3.67 g/L의 arachidonic acid를 얻었다. 이러한 결과는 bench-scale의 발효조에서도 질소원으로 CSP를 이용하여 arachidonic acid의 생산이 가능함을 보여주었다.
돼지감자 분말로부터 대체에너지용 알코올을 생산하기 위하여 우수 inulin 자화 균주로 알려진 Kluyveromyces marxianus UCD(FST)55-82로 알코올 발효 최적 배양조건을 조사한 바 배양 최적 온도 30'C, 최적pH 5.44(돼직감자 자체의 pH), 교반속도 100rpm, 배지의 양 1,000ml(2.5l jar fermenter), 통기하지 않은 상태에서 알코올 생성률이 가장 높았으며 효모의 접종량은 배지량의 2.5로 충분하였다. 또한, 0.01 antifoam A concentrate(silicon polymer)와 0.1 urea의 첨가는 알코올 농도를 효과적으로 증가시키고 발효기간을 단축시켰다. 이와 같은 최적 조건에서 총당질은 배양 하루만에 89.62가 분해되어 알코올 생성 수율이 91.9, 알코올 productivity가 2.71g ethanol/l/h이었고 배양 4일 후에슨 0.7g ethanol/l/h으로 발효액의 알코올 농도는 6.8가 되었다.
본 연구에서는 에탄올의 생산단가를 낮추기 위해, 음식물쓰레기 당화액을 이용하여 효소당화비용을 줄이고 환원당의 기질저해를 감소시키기 위해 회분식의 반연속식 동시당화발효 시스템을 개발하였다. 음식물쓰레기 200 g와 최종효소액 (amylase 기준으로 $3.0\;U/m{\ell}$) $40\;m{\ell}$가 반응하였을 때 생산되는 환원당의 속도는 $35^{\circ}C$에서 $5.84\;g/{\ell}{\cdot}h$로서, strain KJ가 소비하는 환원당 속도는 $-3.88\;g/{\ell}{\cdot}h$와 비슷하여 동시당화발효의 최적온도는 $35^{\circ}C$로 결정되었다. 그리고 음식물쓰레기 당화를 위한 최적 효소농도는 $2.0\;U/m{\ell}$로서 생산되는 환원당의 속도는 4.80 g/L h이었다. 이는 에탄올 생산균주가 $35^{\circ}C$에서 소비하는 환원당의 속도인 $-3.88\;g/{\ell}{\cdot}hr$와 비슷하므로, 효소의 최적농도는 $2.0\;U/m{\ell}$로 결정하였다. Fed-batch식 동시당화발효에서 생산된 환원당을 다 소모하고 나서 12시간 단위로 음식물쓰레기를 공급하여 배양한 결과, 배양 120시간째 에탄올발효 후의 잔존 환원당 농도는 $18.3\;g/{\ell}$, 생성된 에탄올 농도는 $64\;g/{\ell}$, 에탄올의 수율은 0.45 g-ethanol/g-reducing sugar이었다. 그리하여 음식물쓰레기의 Fed-batch식 동시당화발효기술을 개발하여 효소당화비용을 줄이고 환원당의 기질저해를 감소시킴으로써 에탄올 수율을 향상시키는데 성공하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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