Studies have demonstrated that PE_PGRS45 is constitutively expressed under various environmental conditions (such as nutrient depletion, hypoxia, and low pH) of the in vitro growth conditions examined, indicating that PE_PGRS45 protein is critical to the basic functions of Mycobacterium tuberculosis. However, there are few reports about the biochemical function and pathogenic mechanism of PE_PGRS45 protein. The fact that this M. tuberculosis gene is not easily expressed in E. coli may be mainly due to the high content of G+C and the use of unique codons. Fusion tags are indispensable tools used to improve the soluble expression of recombinant proteins and accelerate the characterization of protein structure and function. In the present study, His6, Trx, and His6-MBP were used as fusion tags, but only MBP-PE_PGRS45 was expressed solubly. The purification using His6-MBP tag-specific binding to the Ni column was easy to separate after the tag cleavage. We used the purified PE_PGRS45 to immunize New Zealand rabbits and obtained anti-PE_PGRS45 serum. We found that the titer of polyclonal antibodies against PE_PGR45 was higher than 1:256000. The result shows that purified PE_PGRS45 can induce New Zealand rabbits to produce high-titer antibodies. In conclusion, the recombinant protein PE_PGRS45 was successfully expressed in E. coli and specific antiserum was prepared, which will be followed by further evaluation of these specific antigens to develop highly sensitive and specific diagnostic tests for tuberculosis.
Background: Gintonin is a ginseng-derived exogenous G-protein-coupled lysophosphatidic acid (LPA) receptor ligand. Gintonin exerts its neuronal and non-neuronal in vitro and in vivo effects through LPA receptor subtypes. However, it is unknown whether gintonin can bind to the plasma membrane of cells and can transactivate the epidermal growth factor (EGF) receptor. In the present study, we examined whether gintonin-biotin conjugates directly bound to LPA receptors and transactivated the EGF receptor. Methods: We designed gintonin-biotin conjugates through gintonin biotinylation and examined whether gintonin-biotin conjugate binding sites co-localized with the LPA receptor subtype binding sites. We further examined whether gintonin-biotin transactivated the EGF receptor via LPA receptor regulation via phosphor-EGF and cell migration assays. Results: Gintonin-biotin conjugates elicit [Ca2+]i transient similar to that observed with unbiotinylated gintonin in cultured PC3 cells, suggesting that biotinylation does not affect physiological activity of gintonin. We proved that gintonin-biotin conjugate binding sites co-localized with the LPA1/6 receptor binding sites. Gintonin-biotin binding to the LPA1 receptor transactivates the epidermal growth factor (EGF) receptor through phosphorylation, while the LPA1/3 receptor antagonist, Ki16425, blocked phosphorylation of the EGF receptor. Additionally, an EGF receptor inhibitor AG1478 blocked gintonin-biotin conjugate-mediated cell migration. Conclusions: We observed the binding between ginseng-derived gintonin and the plasma membrane target proteins corresponding to the LPA1/6 receptor subtypes. Moreover, gintonin transactivated EGF receptors via LPA receptor regulation. Our results suggest that gintonin directly binds to the LPA receptor subtypes and transactivates the EGF receptor. It may explain the molecular basis of ginseng physiology/pharmacology in biological systems.
Yong Jung Kang;Young Hoon Kwon;Jung Yoon Jang;Jun Ho Lee;Sanggwon Lee;Yujin Park;Hyung Ryong Moon;Hae Young Chung;Nam Deuk Kim
Biomolecules & Therapeutics
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제31권1호
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pp.73-81
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2023
Sirtuins (SIRTs) belong to the nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)-dependent class III histone deacetylase family. They are key regulators of cellular and physiological processes, such as cell survival, senescence, differentiation, DNA damage and stress response, cellular metabolism, and aging. SIRTs also influence carcinogenesis, making them potential targets for anticancer therapeutic strategies. In this study, we investigated the anticancer properties and underlying molecular mechanisms of a novel SIRT1 inhibitor, MHY2251, in human colorectal cancer (CRC) cells. MHY2251 reduced the viability of various human CRC cell lines, especially those with wild-type TP53. MHY2251 inhibited SIRT1 activity and SIRT1/2 protein expression, while promoting p53 acetylation, which is a target of SIRT1 in HCT116 cells. MHY2251 treatment triggered apoptosis in HCT116 cells. It increased the percentage of late apoptotic cells and the sub-G1 fraction (as detected by flow cytometric analysis) and induced DNA fragmentation. In addition, MHY2251 upregulated the expression of FasL and Fas, altered the ratio of Bax/Bcl-2, downregulated the levels of pro-caspase-8, -9, and -3 proteins, and induced subsequent poly(ADP-ribose) polymerase cleavage. The induction of apoptosis by MHY2251 was related to the activation of the caspase cascade, which was significantly attenuated by pre-treatment with Z-VAD-FMK, a pan-caspase inhibitor. Furthermore, MHY2251 stimulated the phosphorylation of c-Jun N-terminal kinase (JNK), and MHY2251-triggered apoptosis was blocked by pre-treatment with SP600125, a JNK inhibitor. This finding indicated the specific involvement of JNK in MHY2251-induced apoptosis. MHY2251 shows considerable potential as a therapeutic agent for targeting human CRC via the inhibition of SIRT1 and activation of JNK/p53 pathway.
It has been shown that both caloric restriction and exercise, enhances glucose uptake through translocation of GLUT-4 protein. It remains unclear how exercise and caloric restriction affect the changes in VAMP (vesicle-associated membrane protein) in skeletal muscle and GLUT-2 in liver. This study investigated the effects of exercise training and caloric restriction on the expressions of glucose transport relating proteins in muscle and liver tissues in diabetic rats. Forty male Sprague-Dawley rats (250±10 g; 8 week in age) were assigned equally to four different groups; control (C), exercise only (E), dietary restriction only (D) and dietary restriction and exercise (DE). Daily food consumption was monitored to establish baseline intake. Both C and E groups consumed baseline food intake while D and DE groups were provided with only 60% of baseline total food intake. Forty-eight hours after intraperitoneal injection of STZ (50 mg/kg), diabetes was confirmed (8-hr fasting blood glucose levels ≥300 mg/dl). Rats in the E and DE groups exercised on a motorized treadmill for 30 min/d, 5 days/week for 4 weeks (5 min running at 3 m/min, 0% grade; 8 m/min for the next 5min, and then 15 m/min for 20 min). Rats were sacrificed 48 hrs after the last bout of exercise. Soleus muscle and liver were extracted to analyze for GLUT-4, VAMP-2, and GLUT-2, respectively. All variables were analyzed using the Western Blotting technique. All values were expressed as optical volume measured by optical density. A Two-way ANOVA was used to examine the difference between groups and applied Duncan's test for post-hoc. No significant differences in GLUT-2 expression were found among groups. However, E (280133±13228 arbitrary units{AU}) and DE (268833±14424 AU) groups showed significantly higher (p<.001) levels of GLUT-4 as compared with C (34461±2099 AU) and D groups (27847±703 AU). VAMP-2 protein expression increased (p<.001) in E (184137±7803 AU) and DE (189800±10856 AU) groups as compared to C (74201±8296AU) and D (72967±863 AU) groups. These results suggest that either exercise with or without caloric restriction increases the up-regulation of GLUT-4 and VAMP-2 in skeletal muscle of diabetic rats. However, GLUT-2 protein in liver was not affected by either exercise or exercise with caloric restriction.
두경부암(HNC)의 경우, 외과적 개입은 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미칠 수 있으며, 화학요법을 병행하게 된다. 그러나 화학요법에는 현저한 부작용이 있으므로 환자의 고통을 최소화하기 위한 보조 방법의 개발이 필요하다. 천궁(Ligusticum chuanxiong)은 동양 의학에서 뇌혈관 장애 및 두통에 사용되는 천연 허브이다. 본 연구에서는 네트워크 기반 약리학 및 분자 도킹 분석을 통해 천궁의 근본적인 항암기전을 예측하였다. 본 연구에서 HNC와 관련된 천궁의 공통 유전자를 밝혀내어 신경 활성 리간드의 대사 및 신경 전달 물질 경로와의 연관성을 확인했다. 본 연구는 천궁의 성분 중 하나인 (Z)-ligustilide 가 암세포 활성화에 관련된 heat shock protein 90의 ATP 결합 부위를 공유함을 입증했다. 이 결과는 천궁이 보조 항암제 개발을 위한 유망한 후보임을 시사하며, 향 후 더욱 새롭고 안전한 항암제의 연구개발에 과학적 근거를 제시하는 새로운 발견이다.
교정치료시 치아이동은 치주인대세포를 매개로 골조직의 개조가 일어나는 과정으로서 골조직의 성장과 개조는 조골세포, 파골세포 및 그 전구세포의 증식, 분화 및 활성에 영향을 미치는 여러가지 전신적 인자와 국소적 인자에 의하여 조절되고 있다. 1.25-Dihydroxyvitamin $D_3$는 vitamin $D_3$의 대사물로서 경조직에 있어서 칼슘과 인산의 이동에 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 알려져 있으나 치주인대에 대한 1,25-Dihydroxyvitamin $D_3$의 생물학적 기능은 잘 알려져 있지 않다. 1.25-Dihydroxyvitamin $D_3$가 치주인대세포의 활성에 미치는 영향을 관찰하고자 10, 25, 50, 100ng/ml농도의 1,25 Dihydroxyvitamin $D_3$를 배양 치주인대세포에 첨가하여 배양 1, 2, 3일 후 M.T.T. 방법으로 세포의 활성을 관찰하였으며, 백서의 실험적 치아이동시 치주인대 내에 1,25-Dihydroxyvitamin $D_3$를 투여하여 12, 24, 36, 48, 72시간 및 7일 후의 조직 변화 소견을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 10ng, 25ng/ml 농도의 1,25-Dihydroxyvitamin $D_3$를 치주인대세포에 가한 후 배양 1, 2, 3일째의 실험군 활성은 대조군과 차이가 없었다. 2. 50ng/ml 농도의 1,25-Dihydroxyvitamin $D_3$를 치주인대세포에 가한 후 배양 3일째의 활성은 대조군에 비하여 유의하게 증가되었으며 100ng/ml농도에서는 배양 2, 3일째에 유의하게 많았다. 3. 백서에 교정력을 가한 후 인장측에서의 골아세포 활성, 치주인대섬유의 파열, 모세혈관 증식은 투여후 7일까지 1.25-Dihydroxyvitamin $D_3$ 투여측과 대조측 간에 차이가 없었다. 4. 교정력을 가한 후 36시간부터 1,25-Dihydroxyvitamin $D_3$를 투여한 압박측의 파골세포 활성 및 치조골 흡수량이 증가하였다. 이상과 같은 결과로, 50-100ng/ml 농도에서 1,25-Dihydroxyvitamin $D_3$의 농도와 배양 기간에 비례하여 치주인대세포의 활성이 증가하였으며 1,25-Dihydroxyvitarnin $D_3$가 투여 36시간부터 파골세포의 활성과 그에 따른 치조골 흡수량 증가에 영향을 미쳤다고 사료된다.
본 연구는 우리나라에서 재배한 삼채 추출물의 주요생리활성 물질을 2형 당뇨 쥐에 투여하였을 때 인슐린 저항성 개선효과와 췌장에서 β-cell의 형태 및 간 조직의 2형 당뇨 관련 단백질의 발현을 확인 함으로써 그 메카니즘을 확인코자 하였다. 특히 TZDS당뇨약 계열로 현재 시판중인 actoz와 활성을 비교 함으로써 그 유효성 정도를 살펴보고자 본 실험을 디자인하였다. 먼저 식이섭취량, 물 섭취량의 경우, Control군은 2형 당뇨 특징인 다식, 다뇨, 다갈의 형태로 증가하였으나, 삼채 추출물 투여로 식이 및 물 섭취량이 감소하는 경향을 보였다. 식이 투여 2시간 후 혈당변화와 OGTT 검사결과, 2형 당뇨인 Control군에서 혈당의 농도가 가장 높았으나 삼채 추출물 8주 경구투여로 인해 안정화되는 것을 확인할 수 있었으며, serum의 glucose농도 또한 삼채 추출물 투여로 2형당뇨 control군에 비해 혈당이 감소한 것을 확인할 수 있었다. HbA1c (당화혈색소)는 2형 당뇨군(control)에서 9% 수치 범위로 고혈당 범위였으나, 삼채 추출물 섭취로 인하여 Positive control군(actoz 투여군) 7% 수준으로 감소하는 경향을 확인할 수 있었으며, insulin농도는 2형 당뇨인 Control군에서 insulin 농도가 1 ng/ml로 가장 낮은 농도였으며, 삼채 추출물 및 SAC 1.5 ng/ml수준으로 insulin수치가 상승하는 것을 확인할 수 있었다. 혈중 triglyceride, total cholesterol 및 LDL-cholesterol 수치 모두 시료 투여군에서 혈중 지질관련 인자의 농도가 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 AH 400군의 경우 triglyceride, total cholesterol 및 LDL-cholesterol 농도가 각각 482.86±13.40 mg/dl, 163.56±13.24 mg/dl, 142.04±3.24 mg/dl로 대조군에 비해 약 50% 감소한 결과를 나타내었다. 간장 조직 중 지질 과산화의 함량의 경우, 2형 당뇨인 Control군에서 467.74±1.12 MDA nmole/g of tissue로 삼채 추출물 투여(AH 400)로 319.61±26.98 MDA nmole/g of tissue 로 Normal군과 비슷한 수준으로 혈중 lipid peroxide의 함량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 간장조직을 H&E염색한 결과, Normal군에 비하여 2형 당뇨인 Control군의 간 조직에서 많은 지방적이 나타나 지방간이 확인되었으나, Positive control 및 삼채 추출물 투여에 의해 지방적의 크기와 수가 많이 줄어드는 결과를 얻어 조직학적 검사상 지방간의 소견이 현저히 호전되었으며, 췌장에서 insulin 면역화학 염색 결과 2형 당뇨로 췌도 세포가 거의 손상된 것과는 대조적으로, 삼채 추출물을 투여한 결과 정상군과 유사한 형태의 췌도 세포가 확인되었으며 췌도 세포의 형태가 다양한 정도의 과 형성을 보이는 것이 확인되었다. 또한 간장 조직의 PPARγ, PDK4, SREBP-1, FOX0 1의 발현을 확인한 결과, 발현이 2형 당뇨인 Control군에서 모두 발현이 증가하였으나, 삼채 추출물 투여로 인해 발현 정도가 낮게 나타나 앞서 확인하였던 glucose 및 HbA1c 및 insulin농도의 결과와 상통함을 확인하였다. 이들의 결과로 미루어 볼 때, 삼채 메탄올 추출물의 8주간 경구 투여로 인하여 2형 당뇨에 관여하는 PPARγ 단백질 및 비만 관련 단백질 인자를 조절하였으며, insulin농도 및 식후 혈당조절에도 도움을 주는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 췌장의 insulin 면역화학염색 결과, 췌도 세포 형태 및 insulin 합성에도 긍정적인 역할을 하는 것으로 미루어 보아 2형 당뇨에 대한 치료효과가 큰 것으로 사료 된다.
옥수수수염, 율무, 표고버섯 그리고 사과껍질 70% 주정 추출물들(CS, JT, LE, AP)은 항산화 활성이 있었고, 그것 중에 CS가 총폴리페놀 함량, 플라보노이드 함량, DPPH 라디칼 소거작용, ABTS 라디칼 소거작용 그리고 환원력과 같은 항산화 효과가 가장 높았다. 지방분화는 CS, JT, LE, AP 그리고 옥수수수염, 율무, 표고버섯 그리고 사과껍질을 함유한 개발 빵 추출물(DB)을 각각 처리한 3T3-L1 지방세포에서 연구하였다. DB1과 DB2는 지방 전구세포 분화 억제 및 항산화 효과가 있었다. 3T3-L1 지방세포에서 중성지방 축적은 실험한 시료들(CS, JT, LE, AP) 중에서 CS가 분화된 3T3-L1 지방세포에서 TG 축적을 가장 억제하였고 3T3-L1에서 지방분화와 관련된 인자들을 조절하였다. CS는 3T3-L1 세포에서 지방구 형성과 지방세포 분화를 농도 의존적으로 억제하였다. 지방분화 동안 다양한 농도(10, 50, $100{\mu}g/mL$)에서 CS와 함께 처리한 3T3-L1 세포에서 $C/EBP{\beta}$, $PPAR{\gamma}$ 그리고 aP2 mRNA와 단백질 수준에 대한 CS의 영향력을 실험하였고, 3T3-L1 지방세포에 CS 처리는 $PPAR{\gamma}$와 aP2 mRNA 발현을 감소시켰다. CS는 역시 지방분화 중에 $C/EBP{\beta}$, $PPAR{\gamma}$와 aP2 단백질의 증가를 현저하게 저해하였다. 개발된 빵들은 CS에 의해 지방 전구세포(3T3-L1 preadipocytes) 분화 억제 효과가 있고, CS는 3T3-L1 지방세포에서 $C/EBP{\beta}$, $PPAR{\gamma}$와 aP2 신호전달경로를 저해함으로써 지방 전구세포 분화 억제 효과를 나타내었다. JT, LE와 AP는 지방 전구세포 분화 억제 효과는 없었지만 강한 항산화 효과가 있었다. 이들 결과는 개발된 빵이 비만예방 및 억제뿐만 아니라 산화적 스트레스에 의해 유발되는 질병에 도움을 줄 수 있는 건강빵이라는 것을 제안하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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