• 한국수정란이식학회지
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• 제12권1호
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• pp.21-27
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• 1997

The studies were carried out to investigate the effects of bisection method and with and without-zona pellucida of embryos on in vitro developmental rate bisected embryos by micromanipulator, micropipette and pipetting. The ovaries were obtained from slaughtered Korean native cows. The follicular oocytes were cultured in TCM-199 mediurn containing 10 IU /ml의 PMSG(Sigma, USA), 10 IU /ml의 hCG, 1$\mu$g /ml의 $\beta$-estradiol(Sigma, USA) and 10% FCS for 24~48 hrs in incubator with 5% $CO_2$ in air at 38.5$^{\circ}C$ and then, matured oocytes were again cultured for 12~ 18 hrs with motile capacitated sperm by preincubation of heparin. Bisected embryos cultured for 1~5 days in 20% FCS + TCM-199 medium. Survival rate was defined as developmental rate on in vitro culture or FDA-test. The results are summarized as follows :1. The survival rates of bisected bovine embryos by micromanipulator and micropipett were 29.2% and 19.1%, respectively. The rates of non-bisection embryos(46.7%) were significantly higher than those of bisection embryos. 2. The in vitro developmental rates of bisected bovine embryos by micromanipulator, micropipett and pipetting method were 32.4%, 19.4% and 25.6%, respectively.3. The in vitro developmental rates of with and without-zona pellucida of bisected bovine embryos by raicromanipulator were 30.8% and 25.0%, respectively. The rates of nonbisection embryos(53.1%) were significantly higher than those of bisection embryos.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제32권2호
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• pp.91-99
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• 2005

Objective: To define an appropriate vitrification condition of preantral follicle that yields high survival and to evaluate growth and ovulation rate of mouse follicles during in vitro culture after vitrification. Methods: Preantral follicles were isolated mechanically from mouse ovaries that were surgically recovered from mice aged 14 days. Retrieved preantral follicles were placed in EG (Ethylene Glycol) for 2, 5, 10 minutes and transferred to EFS-40 (40% EG, 18% Ficoll-70, 0.5 M sucrose) for 0.5, 1, 2 minutes. And then, preantral follicles were placed onto an EM grid and submerged immediately in liquid nitrogen. Thawing was carried out at room temperature. After defining the most appropriate vitrification condition that yields high survival, in vitro growth and ovulation rate of follicles were evaluated. Results: Appropriate vitrification condition that yield high survival rate ($83.2{\pm}2.1%$) of preantral follicle was EG for 5 minutes and EFS-40 for 0.5 minutes. In vitro survival rate of the vitrified preantral follicles were $85.5{\pm}0.5%$, $67.9{\pm}0.8%$ and $40.2{\pm}0.5%$ on day 2, 6 and 10. And in vitro growth of the vitrified preantral follicles were $107.1{\pm}16.1{\mu}m$, $117.1{\pm}18.4{\mu}m$, $178.4{\pm}45.6{\mu}m$ and $325.4{\pm}54.4{\mu}m$ on day 0, 2, 6 and 10. Although in vitro survival rate and growth of vitrified preantral follicles were lower than that of non-vitrified preantral follicles, the patterns of survival and growth were similar in vitrified and non-vitrified preantral follicles. The ovulation rate of antral follicles that was grown from vitrified preantral follicles was $32.6{\pm}1.2%$. Conclusion: Vitrified preantral follicles could be grown to antral sizes, and mature oocytes that can be used for IVF-ET programs were produced successfully. These data suggest that cryopreservation of preantral follicle by vitrification can be used for the preservation of the fertility.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제47권4호
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• pp.269-276
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• 2020

Objective: We investigated the impact of tyrosine kinase inhibitor (imatinib or dasatinib) coadministration with cyclophosphamide (Cp) on preantral follicle development in an in vitro mouse model. Methods: Seventy-three female BDF1 mice were allocated into four experimental groups: group A, saline; group B, Cp (25 mg/kg); group C, Cp (25 mg/kg) and imatinib (7.5 mg/kg); and group D, Cp (25 mg/kg) and dasatinib (7.5 mg/kg). Preantral follicles were isolated and cultured in vitro up to 12 days. Final oocyte acquisition and spindle integrity of metaphase II (MII) oocytes were assessed. Levels of 17β-estradiol and anti-Müllerian hormone (AMH) in the final spent media were measured by enzyme-linked immunosorbent assays, and the mRNA levels of Star, Sod1, Mapk3, and Casp3 in the final follicular cells were quantified by real-time polymerase chain reaction. Results: The percentage of MII oocytes per initiated follicle, the proportion of MII oocytes with normal spindles, and the 17β-estradiol level were similar in all four groups. The median AMH level in group B (7.74 ng/mL) was significantly lower than that in group A (10.84 ng/mL). However, the median AMH levels in group C (9.96 ng/mL) and group D (9.71 ng/mL) were similar to that in group A. The mRNA expression levels of Star, Sod1, Mapk3, and Casp3 were similar in all four groups. Conclusion: Coadministration of imatinib or dasatinib with Cp could preserve AMH production capacity in this in vitro mice preantral follicle culture model, and it did not affect MII oocyte acquisition.

• 한국수정란이식학회지
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• 제20권1호
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• pp.25-33
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• 2005

본 연구는 가축유전자원의 효율적 보존방법의 개발을 위해 수행되는 체외 정자 세포 생산 연구의 일부로, 생산된 정자 세포의 발생능을 검사하기 위한 체외배양 시스템을 확립 할 목적으로 수행되었다. 성숙 배양시간을 48시간으로 하여 $7\%$ ethanol로 활성화처리한 후 TCM199에 $10\%$의 소 태아 혈청으로 배양하였을 때 배반포까지 발달하지 못하였으나, NCSU23에 $0.4\%$ 소 혈청 알부민으로 배양하였을 때 $3\%$의 활성화된 난모세포가 배반포기까지 발달하였다. 성숙시간을 연장하여 48, 52, 56, 60, 64, 68, 그리고 72시간까지 성숙배양을 실시한 후 $7\%$ 에탄올로 활성화 처리하여 $NCSU23+0.4\%$ BSA로 배양하였을 때 56시간부터 68시간까지 배발달율이 증가하였으나 72시간 성숙배양할 때 배발달율이 다시 저하하여 활성화와 세포질 퇴행간의 윈도우가 56시간부터 68시간 사이인 것으로 추정되었다. 전기자극의 강도를 1, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 그리고 2.0kV/cm로 난모세포를 활성화 처리하였을때 1회 통전으로는 적절한 활성화가 일어나지 않았으며 1.6kV/cm, $80{\mu}s$, 2회 통전이 본 실험조건에서 가장 높은 배발달율을 보였다. 난모세포를 인위적으로 활성화하는데 주로 이용되는 $7\%$ 에탄올법, 전기자극법, 그리고 calcium ionophore법을 직접적으로 비교하였을 때 $7\%$ 에탄올법이 $15.7\%$, 전기 자극법이 $9.5\%$, calcium ionophore법이 $5.8\%$의 배반포 발달율을 보여, 본 실험조건에서는 $7\%$ 에탄올법이 배 발달을 활성화시키는데 가장 효율적인 것으로 나타났다.

• 한국가축번식학회지
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• 제22권4호
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• pp.385-393
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• 1998

본 연구는 돼지 미성숙 난포란을 체외에서 성숙시킬 때, cysteine (CySH) 및 glutathione (GSH) 의 첨가 배양이 난핵포붕괴 및 핵성숙율에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다. 본 연구에서 얻은 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 체외성숙 배양액인 TCM-199 에 cysteine (CySH) 을 각각 0, 0.04, 0.14, 0.6 및 1.2 mM 첨가하여 36 시간 동안 체외성숙을 유기시켰을 때의 난핵포붕괴율은 각각 90.8, 89.9, 90.5, 92.0 및 91.3% 으로서 각 처리구간 유의성이 없었고, 핵성숙율은 각각 56.1, 50.7, 41.9, 49.0 및 61.5%로서 대조구에 비하여 낮은 성숙율을 보였으며, 특히 0.14 mM 및 0.6 mM 첨가군에서 유의적으로 낮은 결과를 보였다 (P＜0.05). 또한, 44시간 동안 체외성숙을 유기시켰을 때 난핵포붕괴율은 각각 90.0, 91.8, 89.8, 90.5 및 89.6%로서 처리구간 유의성이 없었고, 핵성숙율은 각각 80.2, 76.3, 69.4, 66.7 및 72.6%로서 무첨가한 대조구에 비하여 비교적 낮은 성숙율을 보였으며, 특히 0.14 mM 및 0.6 mM 첨가군에서 유의적으로 낮은 결과를 보였다 (P＜0.05). 2. 체외성숙 배양액인 TCM-199 에 glutathione (GSH) 을 0, 0.05, 0.1, 0.5 및 1.0 mM 을 첨가하여 36시간 동안 성숙을 유기시켰을 때 난핵포 붕괴율은 각각 91.0, 90.9, 89.5, 92.0 및 91.1%로서 처리구간 유의성이 없이 높은 결과를 나타냈으며, 핵성숙율은 59.0, 48.5, 47.8, 38.6 및 37.5%로서 대조구에 비하여 모든 처리구에서 유의적으로 낮은 결과를 나타냈다 (P＜0.05). 또한, 44시간 동안 성숙을 유기시켰을 때 난핵포붕괴율은 각각 91.8, 94.1, 89.1, 91.3 및 91.1%로서 모든 처리구에서 높은 결과를 나타냈으며, 핵성숙율은 각각 84.6, 57.1, 69.6, 71.3 및 64.3%로서 대조구에 비하여 모든 처리구에서 유의적으로 낮은 결과를 나타냈다 (P＜0.05).

• 한국가축번식학회지
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• 제22권4호
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• pp.375-383
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• 1998

본 연구는 돼지 미성숙 난포란을 체외에서 성숙시킬 때, $\beta$-mercaptoethanol ($\beta$-ME) 및 Cysteamine 의 첨가 배양이 난핵포붕괴 및 핵성숙율에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다. 본 연구에서 얻은 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 체외성숙 배양액인 TCM-199 에 $\beta$-ME 를 0, 10, 50, 100 및 200 $\mu$M 을 첨가하여 36 시간 동안 성숙을 유기 시킬 때 난핵포붕괴율은 각각 91.6, 92.5, 91.8, 91.9 및 92.7%로서 처리구간 유의성이 없는 높은 결과를 보였고, 핵성숙율은 각각 49.6, 41. 7, 32.5, 34.1 및 35.4%로서 대조구에 비하여 비교적 낮은 성숙율을 보였으며, 특히 50, 100 및 200 $\mu$M 첨가시 유의적으로 낮은 핵성숙율을 나타냈다 (P＜0.05). 또한, 44시간 동안 체외성숙을 유기시켰을 때 난핵포 붕괴율은 각각 91.8, 90.4, 92.5, 91.2 및 93.9%로서 처리구간 유의성 없이 높은 결과를 나타냈으며, 핵성숙율은 71.9, 58.8, 56.7, 62.2 및 56.5%로서 대조구에 비하여 모든 처리구에서 유의적으로 낮은 성숙율을 나타냈다 (P＜0.05). 2. 체외성숙 배양액인 TCM-199 에 cysteamine을 0, 10, 50, 100 및 200 $\mu$M 을 첨가하여 36 시간 동안 성숙을 유기시켰을 때 난핵포붕괴율은 각각 90.6, 86.3, 88.2, 87.2 및 90.0%로서 각 처리구간 높은 결과를 나타냈고, 핵성숙율은 53.8, 45.1, 54.4, 57.5 및 63.3%로서 대조구와 비슷한 결과를 나타냈으며, 특히, 200 $\mu$M 의 첨가구에서 유의적으로 높은 성숙율을 나타냈다 (P＜0.05). 또한, 44 시간 동안 체외성숙을 유기시켰을 때 난핵포붕괴율은 각각 89.5, 93.1, 85.1, 89.8 및 3%로서 모든 처리구에서 높은 결과를 나타냈으며, 핵성숙율은 각각 84.2, 77.6, 66.0, 67.8 및 78.3%로서 대조구에 비하여 전 처리구에서 다소 낮은 결과를 보였으며, 특히 50 및 100 $\mu$M 처리구에서 유의적으로 낮은 핵성숙율을 나타냈다 (P＜0.05).

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제11권3호
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• pp.263-272
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• 2007

생쥐의 난자는 특별한 첨가물이나 난구세포 없이 체외 배양해도 성숙율이 높은 반면 돼지 난자의 체외성숙율은 매우 낮다. 본 연구는 이러한 차이의 원인을 연구하기 위하여 생쥐와 돼지 난자의 에너지 생성에 관여하는 유전자인 malate dehydrogenase(Mor2)의 기능을 RNAi를 이용하여 비교 분석하였다. 생쥐와 돼지 각각의 Mor2 double-stranded RNA(dsRNA)를 제작하고, 생쥐는 난구세포를 제거한 미성숙(GV) 난자의 세포질에 mMor2 dsRNA를 미세 주입한 후 16시간 동안 배양하였고, 돼지는 난구세포를 제거하거나(DO) 혹은 그대로인 상태(COCs)로 pMor2 dsRNA를 미세 주입한 후 48시간 동안 배양하였다. 사용한 배양액은 M199에 10%의 porcine follicular fluid, pyruvate, p-FSH, EGF, cystein, estradiol-$17{\beta}$ 등이 첨가된 배양액을 사용하였고, 배양 후 난자의 형태학적 변화를 관찰하고, Mor2 mRNA양의 변화를 RT-PCR로 확인하여 RNAi 결과, 염기서열 특이적으로 Mor2 발현이 억제됨을 확인하였다. 돼지 난자의 pMor2 RNAi 결과, DO 난자에서는 약 58%의 난자가 MI에서 성숙이 억제되었으나, COCs에선 84.4%가 MII로 성숙하는 것을 볼 수 있었다. 이는 돼지의 난구세포가 난자 성숙에 매우 중요하며, 특히 malate 공급에 관여할 것임을 시사한다. 선행 연구 Mor2 RNAi 결과, 생쥐는 GV에서, 본 연구에서 돼지는 MI에서 성숙이 정지되었기 때문에 이러한 차이가 배양액의 차이인지 다시 mMor2 RNAi 후 생쥐 난자를 M199 배양액에 16시간 동안 배양한 후 성숙율을 관찰하였더니 MII로의 성숙율은 62%로 대조군과 비교하여 큰 차이가 없었다(non-injected: 76.8%, buffer-injected: 73.3%). 이는 mMor2 RNAi 결과가 배양액의 조성에 의해 극복될 수 있음을 보여준 결과다. 생쥐와 돼지에서 서로 다른 대사과정을 갖고 있음은 바로 이 두 종에서의 체외성숙율 차이의 원인이 될 수 있을 것이며, 앞으로 두 종에서의 난자와 난구세포간의 상호작용 및 대사 경로 등에 관한 심도 깊은 비교 분석 연구를 통하여 돼지의 체외성숙율을 증가시킬 수 있는 배양 시스템의 개발이 가능할 것으로 기대된다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제29권3호
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• pp.169-174
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• 2005

본 연구는 배양액의 종류에 따른 돼지 난자의 성숙 및 단위발생란의 배반포 형성율을 검토하였으며, 배양액의 삼투압과 발달 시기에 따른 배양액의 삼투압 변화가 돼지 단위발생란의 발달에 미치는 영향을 검토하였다. 실험 1에서 난포란을 NCSU-23 mWM 및 mKRB에 각각 성숙배양한 결과 성숙률은 $62.1\~71.3\%$로 배양액에 따른 차이가 없었다. 실험 2에서는 각각의 배양액으로 성숙된 난자를 활성화 처리 후 동일한 배양액으로 6일간 배양하여 발달율을 검토한 결과, 배반포 발육율은 NCSU-23에 배양 시 $22.9\%$로 타 그룹($0\~0.6\%$)보다 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 실험 3에서는 단위발생란을 NaCl 안에 의해 256, 280 및 300 mOsmol(mOsm)로 조정한 NCSU-23에 6일간 배양한 결과, 배반포 발육율은 $11.0\~14.4\%$로 실험군 간에 유의적인 차이는 없었으나 삼투압이 낮을수록 난자의 fragment 비율이 높게 나타났다(P<0.05). 실험 4에서는 단위발생란을 삼투압이 조정된 세 종류의 NCSU-23에 48시간 배양한 후 삼투압이 높거나 낮은 NCSU-23으로 옮겨 4일간 추가 배양한 결과 배반포 형성율은 배양 48시간 후에 배양액의 삼투압을 낮춰 주었을 때($21.0\%$)가 높여 주었을 때 ($11.8\%$) 보다 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).본 실험의 결과는 돼지 단위발생란의 발육이 배양액의 종류 및 삼투압에 의해 영향을 받으며, 배양액의 삼투압은 돼지 단위발생란의 발육 단계별로 영향을 주어, 초기에는 높은 삼투압의 배양액에서 배양하고 일정 시간 후 낮은 삼투압의 배양액으로 배양함으로써 발육이 증진될 수 있음을 시사한다.

• 한국가축번식학회지
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• 제17권2호
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• pp.85-92
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• 1993

In the previous study, we observed that Purine has a time dependent effect in maintaining the oocytes in meiotic arrest, and human fetal cord serum(HFCS) and human mature follicular fluid(HMFF) reverse the GVBD suppressed by purines. And it was reported that purine has a harmful effect on the development of oocytes or embryos, when they were cultured for a long time, in vitro. Therefore this study was performed to investigate the effects of purine on extrusion rates of 1st pb and viability of oocytes cultured for a long time, in vitro. Immature oocytes(GV stage) were collected from ovaries of 25~28 day old ICR mice at 48 hrs after PMSG injection. Cumulus-enclosed and denuded oocytes collected were assigned randomly to one of several culture conditions. Some of the oocytes were cultured in 4mM hypoxanthine for 24hr, and the extrusion rates of 1st pb and viability of the oocytes were assessed at every 12 hrs. In the viability, the oocytes showed granulation, pigmentation of cytoplasm or lysis of 1st pb extruded were regarded as degenerating oocytes. Also some of the oocytes were cultured in hypoxanthine for 12 hrs then the resulting oocytes were transferred to hypoxanthine-free medium and cultured for 12 hrs to determine whether the inhibitory effect of hypoxanthine on the 1st pb extrusion was reversible. The rest of the oocytes were cultured in medium containing hypoxanthine and adenosine for 18 hrs to compare the 1st pb extrusion be attendant upon hte concentration of HFCS or HMFF supplemented. Hypoxanthine suppressed the extrusion of 1st pb and viability of the oocytes significantly, when they were cultured for more than 12 hrs and the harmful effect of hypoxanthine was showed in denuded oocytes, prominently. The suppressive effect of hypoxanthine was reversed by just removal of the hypoxanthine from the cultrue medium. Also there was no difference in reverse the pb extrusion rate suppressed between HFCS and HMFF. The extrusion rate of 1st pb in medium containing adenosine and hypoxanthine was increased in line with the concentration of HFCS or HMFF supplemented. Hypoxanthine suppressed the extrusion of 1st pb and viability of the oocytes significantly, when they were cultured for more than 12 hrs and the harmful effect of hypoxanthine was showed in denuded oocytes, prominetly. The suppressive effect of hypoxanthine was reversed by just removal of the hypoxanthine fromthe culture medium. Also there was no difference in reverse the pb extrusion rate suppressed between HFCS and HMFF. The extrusion rate of 1st pb in medium containing adenosine and hypoxanthine was increased in line with the concentration of HFCS or HMFF supplemented.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제46권4호
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• pp.152-165
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• 2019

Objective: This study aimed to examine the effect of vitrification on apoptosis and survival in human preantral follicles after thawing. Methods: This experimental study was conducted at an acute tertiary care hospital from March 2012 to April 2013. Ovaries were sliced into 5 × 5 × 1-mm pieces and divided into the following three groups: preantral follicle isolation, ovarian tissue vitrification-warming followed by follicle isolation, and immunohistochemistry of fresh ovarian tissue. For statistical analyses, the Student t-test, chi-square test, Kruskal-Wallis test, and Kaplan-Meier survival analysis were used. Results: A total of 161 preantral follicles (70% secondary) were collected from ovarian cortex tissue of six women between 30 and 37 years of age who underwent oophorectomy due to cervical cancer or breast cancer. There were no significant differences in the follicular morphology of fresh preantral follicles and vitrified follicles after thawing. The mean Fas ligand (FasL) mRNA expression level was 0.43 ± 0.20 (relative to β-actin) in fresh preantral follicles versus 0.51 ± 0.20 in vitrified follicles (p= 0.22). The mean caspase-3 mRNA expression level in fresh preantral follicles was 0.56 ± 0.49 vs. 0.27 ± 0.21 in vitrified follicles (p= 0.233). One vitrified-thawed secondary follicle grew and developed to an antral follicle within 6 days of culture. Conclusion: Vitrification did not affect preantral follicle morphology or mRNA expression of the apoptosis markers FasL and caspase-3. Further studies are required to establish whether vitrification affects the outcomes of in vitro culture and the maturation of preantral follicles.