• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제41권1호
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• pp.11-19
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• 1994

연구배경 : 결핵균은 facultative intracellular pathogen으로 대식세포에서 생존 번식할 수 있으며, 결핵균이 체내에서 제거되려면 대식세포와 T 임파구에 의한 효과적인 세포매개성 면역반응이 필요하다. 폐포대식세포에 의한 결핵균 살균은 크게 산소의존성 과정과 산소비의존성 과정으로 구분되는데 산소의존성과정은 NADPH oxidase에 의해 산소가 환원반응으로 과산화음이온을 생성하는 과정으로 시작된다. 저자들은 폐결핵환자의 경우 폐포대식세포의 산소유리기 생성의 이상으로 결핵균이 세포내 오래 생존 번식할 것으로 추정하여 폐결핵환자와 대조군에서 폐포대식세포와 말초혈액 단구세포를 분리하여 분비되는 과산화음이온의 양을 비교하여 보았다. 방법 : 대조군과 폐결핵환자에서 폐포대식세포와 말초혈액내 단구세포를 분리하여 기저상태 및 PMA로 자극한 후 분비되는 과산화음이온의 양을 ferricytochrome-C를 환원시켜 나타나는 발색반응을 이용하여 측정하였고, 단구세포의 경우 결핵환자의 혈청에 의해 어떤 변화를 보이는지 관찰하였다. 결과 : 1) 폐포대식세포에서 분비하는 과산화음이온은 폐결핵환자군와 대조군 사이에 차이가 없었고, PMA로 자극을 했을 때도 두군 사이에 차이가 없이 모두 유의한 증가를 보였다. 2) 말초혈액 단구세포에서 분비하는 과산화음이온은 폐결핵환자군과 대조군 사이에 차이가 없었지만, PMA로 자극을 했을 때 두군에서 모두 유의한 증가를 보였고 폐결핵환자군이 대조군에 비해 높았다. 한편 결핵환자 혈청으로 폐결핵환자군과 대조군의 말초혈액 단구세포를 자극했을 때도 두군에서 모두 유의하게 증가되었다. 결론 : 폐포대식세포와 말초혈액 단구세포에서 분비하는 과산화음이온의 양은 정상인과 폐결핵환자에서 차이가 없었다. 따라서 폐포대식세포에서의 과산화음이온 분비가 부족하여 결핵균이 폐포대식세포내에서 장기간 생존하는 것으로 생각되지 않으며, 오히려 결핵환자의 혈청내에는 말초혈액 단핵구의 과산화음이온 분비를 자극하는 물질이 있을 것으로 생각되나, 정상인 혈청이 과산화음이온 생성에 미치는 효과에 대한 비교 연구가 필요할 것으로 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제23권1호
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• pp.75-84
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• 1999

본 연구는 토끼 전핵배의 효율적인 생산을 위한 동결방법과 조건 등을 찾고자 유리화 동결 및 완만동결법으로 동결ㆍ융해 후 체외배양하여 생존율 및 발달률을 조사하였다. 과배란시킨 토끼의 난관으로부터 채란된 전핵배를 동결에 공시하였다. 유리화 동결은 동결보호제로 EFS 와 EPG-I을 완만동결시는 EPG-II를 사용하였다. 동결ㆍ융해 후 5%, 39$^{\circ}C$ $CO_2$incubator 에서 소 난관상피세포와 공배양하였다. 본 실험의 결과는 다음과 같다. 동결보존을 위하여 동결보호제에 적절한 평형시간과 독성 여부를 판단하기 위하여 전핵배를 EFS 용액에 0~5분간 평형시킨 후 부화배반포로의 발달률은 1 분 군에서 72.0%로 동결보호제에 노출시키지 않은 대조구 (84.1%)에 비하여 무해한 결과를 얻었으나, 그 이상에서는 유해한 결과를 보여 주었다. EFS 노출 후 희석제로 sucrose와 D-PBS를, sucrose 사용 없이 D-PBS 만으로 희석하였을 때 유의적인 (P＜0.05) 차이를 보이지 않았다. 동결보호제에 있어서는 독성검사 및 동결ㆍ융해 후 발달률을 보아 EFS, EPG-. EPG-II는 동결보존에 있어서 동결보호제로서의 가능성을 보여주었으며 서로간의 유의적인 (P＜0.05) 차이는 찾아볼 수 없었다. 유리화동결에 의한 전핵배의 부화배반포로 발달률은 6.1%를 나타내었고, 완만동결에 의한 부화배반포 발달률은 11.5%로서 동결방법간에는 유의적인 (P＜0.05) 차이가 없었다. 완만동결시 동결속도가 전핵배의 투명대 파열에 미치는 영향을 규명하기 위하여 동결속도 및 침지온도를 달리하여 조사하였을 때 －35$^{\circ}C$ (25%) 보다는 －85$^{\circ}C$ 0.9%) 에서 액체질소에 침지하였을 때가 투명대 파열률에 있어 유의적인 (P＜0.05) 차이를 보였다. 이상의 결과로부터 전핵배는 현 배양상태에서 유리화동결 및 완만동결에 의하여 동결보존이 가능하다고 사료되나 전핵배의 배반포로의 발달률은 다소 저조하였다. 유리화동결 및 완만동결에 의한 전핵배는 후기 단계의 수정란보다 물리적, 화학적 손상에 더욱 민감하여 생존율 및 발달률에 영향을 미친다고 사료된다.

• Radiation Oncology Journal
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• 제11권1호
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• pp.35-42
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• 1993

원자력 시설 이용 증대에 따른 불의의 방사선 사고에 대비하여 방사선 작업종사자의 피폭시 진단을 위한 검사방법이 필요하다. 이 방법은 검사를 위한 검체의 채취가 용이하고, 짧은 시간내에 간편하게 많은 Sample을 처리하여야 한다는 조건을 만족시켜야 한다. 인체의 다양한 조직 및 세포 중에서 위의 조건을 만족시킬 수 있는 말초 혈액의 림파구는 비교적 방사선에 대한 감수성이 높다고 알려져 있으며, 채집 또한 용이하여 생물학적 선량 측정의 도구로써 이용가치가 높아 방사선 작업 종자사나 피폭 가능성이 있는 사람의 screening test에 사용될수 있다. 정상인에 있어서의 림파구내 미세핵 존재 여부와 방사선 피폭량에 따른 미세핵 발생빈도를 시험관내 실험을 통하여 표준화시켜 향후 방사선 피폭시 피폭선량을 역으로 산출해 낼 수 있는 방사선 장해의 평가 기술 개발의 기초자료를 마련하기 위하여 본 실험을 시행하였다. 정상인으로 부터 혈액을 채취하여 림파구만을 Ficoll-Hypaque gradient 방법으로 추출하여 배양한 다음, 본 치료방사선과의 중성자 치료기 (MC-50, scanditronix)와 Co-60 teletherapy unit(Theratron-780, AECL)를 이용하여 방사선 조사를 시행하였다. Cytokinesis-block method를 이용하여 첫번째 분열을 한 림파구에서 미세핵(Micronucleus)을 현미경을 통하여 계수한 다음, 이의 선량-반응 관계식을 linear-quadratic model을 사용하여 구하고, 이를 근거로 하여 gamma-ray에 대한 중성자의 Relative biological effectiveness (RBE)를 산출하였다. 방사선에 피폭되지 않은 림파구의 미세핵 발생빈도는 binucieated cell한 개당 $0.013{\pm}0.0002$로써 사람에 따라 통계학적으로 큰 차이를 보이지 않았다. 그림 2와 3에서 보는 바와 같이 개개인으로부터 얻은 data는 감마선과 중성자선 모두에서 선량-반응 곡선의 linear-quadratic equation에 잘 일치하였다. 감마선과 중성자선 모두에서 선량에 따른 미세핵의 발생빈도는 선량이 높을수록 비례하여 증가하였는데, 감마선의 경우에는 $r^2=1.000,\;x^2=0.7074$, p=0.95였으며, 중성자선인 경우에는 $r^2=0.996,\;x^2=7.6834$, p=0.11 였다. 이를 linear-quadratic model로 분석하면, 가장 적합한 선은 감마선인 경우에는 y= ($0.31{\pm}0.049)\;D+(0.0022{\pm}0.0002)\;D^2+(13.19{\pm}1.854$) 였으며, 중성자선인 경우에는 y=($0.99{\pm}0.528)\;D+(0.0093{\pm}0.0047)\;D^2+(13.31{\pm}7.309$) 였었다. 감마선에 대한 중성자선의 상대적 생물학적 효과비 (RBE)는 y=aD+$bD^2$+c를 다음과 같은 식으로 변형시켜 계산하였다. $$\frac{[-a{pm}\sqrt{a^2-4b\;(c-y}}]}{2{\times}6}$$ 미세핵 발생빈도가 세포당 0.05와 0.8사이에서의 중성자선의 상대적 생물학적 효과비는 $2.37{\pm}0.17$ 이었다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 선량에 따른 미세핵 발생빈도는 기존의 방사선 감수성 test의 결과와 대동소이하여, 앞으로 방사선 감수성을 측정하는 방법으로 이용할 수 있으며, 또한 실험방법이 비교적 간단하며 짧은 시간에 결과를 도출할 수 있어 생물학적 선량측정 도구로써 널리 이용될 수 있을 것으로 생각되어 진다.

• 한국임상수의학회지
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• 제26권6호
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• pp.528-533
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• 2009

본 연구에서는 사람 제대혈로부터 간엽줄기세포를 분리하고, 이들을 체외에서 다량 증식시키며, 나아가 이들 간엽줄기세포를 특정한 세포로 분화시키고자 하였다. 사람의 제대혈로부터 단핵세포를 Ficoll-density gradient 법으로 분리하고, 이를 10% 우태아혈청, L-glutamnie, 및 항생제가 첨가된 DMEM 배양액과 Keratinocyte 배양액으로 $37^{\circ}C$ 5% $CO_2$ 배양조건에서 계대배양으로 증식시키고 현미경으로 줄기세포의 발달과 형태학적 성상을 확인하였으며, PAS 염색 및 PACS 분석으로 간엽줄기세포임을 확인하였다. 이들은 체외에서 연골세포로 분화를 유도하였고, 이들 분화된 줄기세포는 면역조직화학적 검사법으로 연골세포 특이 물질에 대한 Safranin O 염색법 및 Type II collagen 염색법을 실시하여 이들의 발현을 확인하였으며 RT-PCR을 실시하여 특이 mRNA 발현을 확인함으로서 연골세포로 분화된 것임을 확인하였다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제42권5호
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• pp.703-712
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• 1995

연구배경: 말초혈액 단핵구는 정상적인 면역반응에 중요한 세포로서 탐식 기능과 항원 제공 기능외에 다양한 종류의 Cytokine을 생성하며, 이중 IL-8은 호중구에 대한 강력한 주화 작용과 직접적인 활성화 작용 등을 통해서 염증 작용을 증폭시키는 역할을 하는 것으로 알려져 었다. 따라서 IL-8 작용의 억제를 통하여 항염 효과를 기대할 수 있으며, 이러한 작용을 나타낼 것으로 기대되는 Dexamethasone, $PGE_2$, Indomethacin 및 IFN-$\gamma$를 이용하여 이러한 약제들이 말초혈액 단핵구에서 내독소 자극에 의한 IL-8의 생성 자극 효과에 어떤 영향을 미치는 지에 대해서 알아보았다. 방법: 말초혈액 단핵구는 자원자에게서 채취한 혈액을 Ficoll Hypaque density gradient method에 의해서 백혈구 층을 분리한 뒤에 플라스틱 접시에 부착함으로써 분리하였다. Dexamethasone, $PGE_2$, Indomethacin은 내독소로 자극하기 한 시간 전, 후에 처치하였고, IFN-$\gamma$는 내독소로 자극하기 한 시간 전에만 전처치 하였다. 내독소로 자극한 뒤 4시간 뒤에 RNA를 extraction한 뒤 Northern blot analysis를 시행하여 IL-8 mRNA를 분석하였고, 24시간 뒤에 ELISA를 통하여 IL-8 단백을 정량하였다. 이 과정을 3회 반복하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 결과: 1) Dexamethasone의 전, 후 처치는 내독소 자극에 의한 IL-8 mRNA와 단백의 생성을 감소시켰다. 2) IFN-$\gamma$의 단독 투여는 내독소 자극을 받지 않은 군에서 IL-8 mRNA와 단백의 생성을 감소시켰다. 3) 내독소 투여 전에 IFN-$\gamma$를 전 처치 하였을 때, 내독소 단독 투여군에 비해 IL-8 mRNA 발현은 감소하였으나 IL-8 단백의 분비에는 차이가 없었다. 4) $PGE_2$와 Indomethacin은 각각 사용한 농도($10^{-6}M$, $10{\mu}M$)에서는 내독소 자극에 의한 IL-8 mRNA 및 단백의 생성에 별다른 영향을 미치지 못하였다. 결론: Dexamethasone은 말초혈액 단핵구에서 내독소의 자극에 의한 IL-8 mRNA 발현 및 단백의 생성을 억제함으로써 염증 반응을 억제할 것으로 기대된다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제42권6호
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• pp.862-870
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• 1995

연구배경: 산소기의 작용은 과거에는 세포독성이 주로 알려져 있었던 반면, 최근 들어 산소기의 세포내 신호전달체계에서의 역할에 많은 사람의 관심이 모이고 있다. 여러 cytokine의 전사인자(transcription factor)로 작용하는 $NF{\kappa}B$는 기저상태에서는 세포질에 존재하는데 $I{\kappa}B$와 결합되어 핵내로의 이동이 억제되고 있다. 여러 연구에 의해 $NF{\kappa}B$의 $I{\kappa}B$로부터의 분리는 외부자극에 의해 생성된 산소기에 의한 것으로 알려졌는데, 이렇게 하여 분리된 $NF{\kappa}B$가 핵내로 이동하면 핵내에서 전사인자로 작용하여 여러 유전자의 전사를 증가시키는 것이 보고되었다. IL-8 유전자는 5'flanking promotor region에 $NF{\kappa}B$-like motif가 있어 핵내 $NF{\kappa}B$ activity의 증가로 IL-8 유전자의 전사가 증가되는 것으로 알려졌고, 또한 내독소는 핵내의 $NF{\kappa}B$ activity의 증가와 함께 호중구에서의 산소기의 분비를 가져온다. 이러한 사실로부터 내독소에 의한 IL-8 유전자의 발현은 세포내에서 생성된 산소기에 의해 $NF{\kappa}B$가 $I{\kappa}B$로부터 분리되어 핵내로 이동하고 이로 인해 IL-8 유전자의 전사가 증가되는 가설을 생각할 수 있다. 저자들은 이러한 가설 검정의 첫번째 단계로써 체내 염증반응에서 중요한 역할을 하는 말초혈액 단핵구의 IL-8 및 IL-$1{\beta}$ 유전자 발현에 세포내의 산소기가 관여하는지의 여부를 평가하고자 본 연구를 시행하였다. 방법: Ficoll-Hypaque density gradient 법과 plastic 부착법을 이용하여 말초혈액 단핵구를 분리하였다. 외부에서 투여한 산소기의 농도에 따른 IL-8 및 IL-$1{\beta}$ mRNA 발현의 유무를 관찰하기 위하여 $H_2O_2$를 0, 10, 100, $300{\mu}M/L$, 1mM/L의 농도로 투여하고 6시간이 경과한후 IL-8 및 IL-$1{\beta}$에 대한 Northern blot analysis를 시행하였다. 시간에 따른 IL-8 및 IL-$1{\beta}$ mRNA 변화를 관찰하고자 $H_2O_2$를 $100{\mu}M/L$의 농도로 투여하고 0, 2, 4, 6, 8, 24시간이 경과한 후 Northern blot analysis를 시행하였다. 항산화제가 내독소에 의한 IL-8과 IL-$1{\beta}$ mRNA 발현에 미치는 영향을 평가하기 위하여 TMTU(10 mM/L) 1시간; PDTC($100{\mu}M/L$) 1시간, NAC(10 mM/L) 2.5시간, ME(10mM/(L) 2.5시간, Desferrioxamine(100mM/L) 15시간 동안 전처치 한 디음 내독소를 투여허여 4시간이 경과한 후 IL-8 및 IL-$1{\beta}$ mRNA에 대한 Northern blot analysis를 시행하였다. 결과: $H_2O_2$농도 및 시간에 따른 말초혈액 단핵구에서의 IL-8 및 IL-$1{\beta}$ mRNA의 발현에는 유의한 차이가 관찰되지 않았지만 항산화제로 전처치하였을 때 내독소에 의한 말초혈액 단핵구에서의 IL-8 및 IL-$1{\beta}$ mRNA의 발현이 억제되었고 그 억제정도는 TMTU에서 가장 현저하였다. 결론: 이상의 결과에서 말초혈액 단핵구에서의 IL-8 및 IL-$1{\beta}$ mRNA 발현에 $H_2O_2$가 아닌 다른 산소기가 일부 관여할 것으로 생각된다.