• 제목/요약/키워드: Extracellular Inulinase

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Bacillus sp.가 세포외로 생산하는 Inulinase의 정제 및 특성 (Purification and Characterization of Extracellular Inulinase from Bacillus sp.)

  • 김경남;최용진
    • 한국미생물·생명공학회지
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    • 제18권5호
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    • pp.490-495
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    • 1990
  • 토양 분리균인 Bacillus spp.가 생산하는 inulinase를 ammonium sulfate 분획, 열처리, DEAE Sephadex Cl-6B ion exchange chromatography, Sephadex G-100 및 Sephadex G-150 gel 여과 등의 과정을 거쳐 단일 단백질로 분리 정제하였다. 정제 inulinase는 분자량이 약 56,000인 효소로서 pH6.0,$50^{\circ}C$에서 최대 활성을 나타내었으며 $Co^{2+}$$Mn^{2+}$에 의해서 현저한 활성화 효과를 보였다. 또한 본 효소는 sucrose와 raffinose에 대해서도 높은 활성을 나타내므로 $\beta$-D-fructofuranosidase(EC 3.2.1.26)로 분류되는 exo-inulinase인 것으로 확인되었다. 한편 효소활성에 필수적인 아미노산 잔기는 tryptophan과 histidine인 것으로 분석되었으며 inulin과 sucrose에 대한 $K_m$값은 각각 $2.0 \times 1.0^[-3}M, 1.0 \times 10^[-2}M$로 산출되었다.

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재조합 Saccharomyces cerevisiae에서 Inulinase의 발현과 국재성 (Expression and Localization of Inulinase in Recombinant Saccharomyces cerevisiae)

  • 남수완;우문희;김병문;정봉현;박영훈
    • 한국미생물·생명공학회지
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    • 제22권2호
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    • pp.152-157
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    • 1994
  • Inulinase of Kluyveromyces marxianus origin was produced by recombinant yeast Saccharomyces cerevisiae under the control of GAL1 promoter, to examine the expression and localization of inulinase in a repressed(galactose-free) or derepressed(galactose-containinga) medium. The inulinase gene(INU1A) was constitutively expressed at 6.7 units/ml in a repressed medium. When the cell started to utilize galactose in a derepressed medium, the INU1A gene began to be expressed, and the final expression level reached about 45 units/ml. According to be the nondenaturingPAGE analysis, inulinase produced by S. cerevisiae was found to be less glycosylated than the bakers yeast invertase. In addition, its glycosylation pattern was less heterogeneous than the K. marxianus inulinase. The supplementation of inulin or raffinose into the derepressed medium increased the cell growth rate, while the expression of INU1A was repressed. Regardless of the carbon sources examined, most of inulinase activity (more than 98%) was found in the extracellular medium, indicating excellent secretion efficiency.

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Accumulation of Selenium and Changes in the Activity of Inulinase and Catalase in the Cells of Kluyveromyces marxianus on Pulsed Electric Field Treatment

  • Pankiewicz, Urszula;Jamroz, Jerzy
    • Journal of Microbiology and Biotechnology
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    • 제20권7호
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    • pp.1101-1106
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    • 2010
  • Pulsed electric field (PEF) of 1Hz, 1.5 kV, and 1ms increased the activities of catalase and inulinase over the whole range of applied Se concentrations compared with the non-treated cultures. A significant effect of selenium concentration (in the range of 5-14 ${\mu}g/ml$) on both intra- and extracellular enzyme activities was noted. At a Se concentration of 10 ${\mu}g/ml$, the activities of intra- and extracellular inulinases and extracellular catalase in the PEF-treated cultures reached the maximum of 71 U/g d.m., 46 U/g d.m., and approx. 8 U/ml, respectively. The maximum activity of intracellular catalase of approx. 6 U/ml (with and without PEF) was recorded at 5 ${\mu}g$ Se/ml. Further increasing of selenium concentration caused a decrease in the activity of the enzymes.

Pseudomonas sp. Inulinase 유전자의 클로닝 및 Escherichia coli에서의 발현 (Molecular Cloning of Pseudomonas sp.Inulinase Gene and its Expresstion in E. coli)

  • 엄수정;권영만;최용진
    • 한국미생물·생명공학회지
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    • 제23권5호
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    • pp.550-555
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    • 1995
  • A strain of Pseudomonas sp. isolated from soil was shown to produce a high level of extracellular endo-inulinase. In this work, the endo-inulinase gene (inu1) of the bacterial strain was cloned into the plasmid pBR322 by using EcoRI restriction endonuclease and E. coli HB101 as a host strain. One out of 7, 000 transformants obtained from the above cloning experiment formed a clear zone around its colony on the selective medium supplemented with 2.0% inulin after a prolonged incubation at 37$\circ$C and subsequent cold shock treatment. The functional clone was found to carry a recombinant plasmid (pKMG50) with a 3.7 kb genomic insert containing the genetic information for the inulinase activity. The inulinase from E. coli HB101/pKMG50 was proved to be an endo-acting enzyme and produced constitutively in the recombinant E. coli cells. Zymogram of the enzyme from the recombinant cells with inulin substrate indicated that the molecular mass of the active protein was 190 Kd, while that of the endo-inulinase from the Pseudomonas strain was 170 Kd. This size discrepancy suggested that the inulinase from the recombinant E. coli HB101 cells might be the initial product of translation, not the mature form produced in the strain of Pseudomonas sp..

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Pseudomonas sp.의 균체외 Endo-Inulinase 특성 (Characteristics of Extracellular Endo-Inulinase Produced by Pseudomonas sp.)

  • 이태경;신현철;최용진;양한철
    • 한국미생물·생명공학회지
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    • 제16권6호
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    • pp.484-488
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    • 1988
  • 토양분리균 Pseudomonas sp.가 생산하는 inulinase를 분리.정제하여 얻은 단일 단백질 효소 PI과 PII는 탄수화물 함량이 각각 15%와 2.4%인 당 단백질 형태의 endo-inulinase로서 두 효소가 모두 촉매활성에 필수적인 tryptophan 잔기를 가지고 있었다. 분자량은 PI 210,000, PII 170,000으로 측정되었다. 1mM pCMB 존재에 의해 두 효소가 약80% 정도의 활성저해를 보였으나 5mM cysteine 또는 1mM dithiothreitol을 첨가하면 효소활성이 거의 완전 회복되는 특성을 나타내었다. 최종 가수분해산물인 fructose(1mM)에 의해 PI, PII 효소가 각각 15% 정도의 활성저해를 받는 반면 Co$^{+2}$ 이온은 50~60%의 높은 활성화 효과를 보였다. 두 효소는 pH 4.0~7.5사이에서 매우 안정하였으며, 열에 대하여서도 비교적 안정하여 6$0^{\circ}C$, 120분 가열에 의해 PI이 약 27%, PII가 약 40%의 실활을 나타낼 뿐이다. 또한 60units의 효소를 사용, 2% inulin을 5$0^{\circ}C$에서 72시간 가수분해 시켰을 때 PI약 70%, PII약56%의 기질 분해율을 보였다.

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Pseudomonas sp.가 생산하는 Inulinase에 관한 연구 -효소의 정제와 성질 - (Purification and Properties of Extracellular Inulinase of Pseudomouas sp.)

  • 이태경;최용진;양한철
    • 한국미생물·생명공학회지
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    • 제16권4호
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    • pp.259-264
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    • 1988
  • Pseudomonas sp.로 동정된 토양분리균의 inulinase를 ammonium sulfate 분획, DEAE Sephadex A-50 Chromatography, Sephadex G 100 및 Sephadex G200 gel여과 등의 과정을 거쳐 정제 한 결과 inulinase PI과 PII의 두 isoenzyme으로 분리되었으며 각각 약 24배와 17배 정제되어 단일단백질로 분리되었다. PI, PII 두 isoenzyme은 다같이 sucrose, raffinose 및 levan은 분해하지 못하고 inulin만을 endo-type로 분해 절단하는 $\beta$-2,1-fructanfructano hydrolase(EC 3.2.1.7)임이 밝혀졌다. 효소활성 최적온도는 두 효소가 같은데 비해 (55$^{\circ}C$), 최적 pH는 PI이 pH5.5, PII가 pH6.0으로 약간의 차이를 보였다. Inulin에 대한 Km값은 PI ; 2$\times$$10^{-3}$M, PII : 5$\times$$10^{-3}$M로써 PI효소가 PII보다 약간 높은 친화력을 보였다.

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Sacharomyces cerevisiae에서 GAL또는 GAP 프로모터 조절에 의한 재조합 Inulinase의 발현 및 분비 (Expression and Secretion of Recombinant Inulinase under the Control of GAL or GAP Promoter in Sacharomyces cerevisiae)

  • 남수완;임현정정봉현장용근
    • KSBB Journal
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    • 제11권4호
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    • pp.445-452
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    • 1996
  • 본 연구에서는 GALl, GALl, GALlO 및 GAP promoter 하류에 reporter 유전자인 K. marxianus의 inulinase 유전자(lNUl)를 연결하여 각각의 재조합 plasmid들을 구축하고, 이들로 형질전환된 S. cerevrswe를 회분배양(YPOG 배지 )하여 외래 유전자 발현에 미치는 promoter의 영향을 비교.검토하 였다. 재조합 효모의 최종 균체농도는 36-39 00600 값을 보여 promoter에 따른 큰 차이를 보이지 않았으나, 포도당 소모기간 동안 비증식속도는 평균 $0.24 h^{-1}$로 유지되다가 galactose 소모기간 동안에 GAL promoter 함유 효모배양의 경우 $0.04-0.06 h^{-1}$, pYIGP 함유 재조합 효모배양은 $0.10 h^{-1}$로 감소하였다. 포도당 고갈 후 inulinase 발현은 시작되었고 균체외 inulinase의 발현 수준은 배양 72시간에 4.3 (GALl promoter), 4.0 (GAL7 promoter), 3.8 (GAL10 promoter) 및 1.6 (GAP promoter) unit/mL에 도달하였다. 평판배지상에서의 활성염색과 회분배양의 결과(최종발현양 및 초기 inulinase 말현속도), inulinase 발현에 미치는 promoter 세기 는 GALl > GALlO > GAL7 > GAP 순임을 알 수 있었다. GAL promoter가 배양말기까지 78 % 이상의 높은 plasmid 안정성을 보인 반면에, GAP promoter의 경우 55%의 낮은 plasmid 안정성을 보였다. 또한, 재조합 inulinase는 promoter 종류에 상관없이 98% 이상 배양액으로 분비되였다.

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Penicillium sp. 유래 Inulinase의 정제 및 특성 (Purification and Characterization of Inulinase from Penicillium sp.)

  • Seok-Yong Kim;Seok-Jong Suh;Seon-Hwa Ha;Seon-Kap Hwang;Joo-Hyun Nam;Dong-Sun Lee;Soon-Duck Hong;Jong-Guk Kim
    • 생명과학회지
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    • 제8권5호
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    • pp.614-621
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    • 1998
  • 열안정성 inulinase를 분비하는 Penicillium sp.를 돼지 감자 서식지의 토양으로부터 분리하여 이 균주의 inulinase를 50%-80% 염석, DEAE-Sephacel column chromatography, Toyopearl HW 65 F column chromatography에 의해 정제하여 inulinase 활성을 가진 단일 band를 얻었다. 이 band의 단백질을 polya-cryamide gel electrophoresis 후 추출하여 inulinase 활성을 가지는 것으로 확인되었다. 이 단백질의 분자량은 SDS-PAGE에 의해 약 77,000 dalton으로 추정되었고, 최종 정제도는 53.3배이었다. 정제된 효소의 효소학적 성질을 조사한 결과, 최적온도는 약 6$0^{\circ}C$이었고, 열 안정성은 30-5$0^{\circ}C$에서 비교적 안정하였다. pH 4에서 가장 높은 활성을 나타냈으며, pH 4-5에서는 비교적 안정했고 염기성에서는 아주 낮은 활성을 나타내었다. 금속이온과 다른 화학물질의 영향을 조사한 결과 1mM의 $MnCl_2$$CaCl_2$에 의해 활성이 증가했으며 특히, $MnCl_2$는 1.7배까지 활성을 증가시켰다. 그러나, 1mM의 $CuCl_2$,$HgCl_2$와 1mM EDTA 시에는 활성이 저해되었다. TLC분석결과 모든 산물이 monosaccharide였으므로 이 효소는 exo-acting inu-linase로 추정되었고, inulin에 대한 이 효소의 $K_M$치는 $2.2\times10^{-3}$이었다. 이 효소의 결정된 N-terminal 아미노산 배열은 $NH_2$-X-Glu-Tyr-Thr-Glu-Lys/Leu-Tyr-Arg-Pro이다.

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Purification and Characterization of an Inulin Fructotransferase from Flavobacterium sp. LC-413

  • Cho, Chul-Man;Lee, Sang-Ok;Hwang, Ji-Sook;Jang, Kyung-Lip;Lee, Tae-Ho
    • Journal of Microbiology and Biotechnology
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    • 제7권2호
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    • pp.121-126
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    • 1997
  • A bacterial strain LC-413, producing an extracellular inulin fructotransferase (depolymerizing) which converts inulin into di-D-fructofuranose dianhydride (DFAIII), was isolated from soil. Inulin fructotransferase from the isolate identified as a strain Flabobacterium sp. was purified from the culture broth by ammonium sulfate precipitation, followed by column chromatograpies on DEAE-Toyopearl 650 M and phenyl-Toyopearl 650 M. The purified enzyme gave a single band on an electrophoretic disc-gel. The molecular weight of the enzyme was estimated to be 44, 000 Da by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and 45, 000 Da by gel filtration, suggesting the monomeric state of the enzyme. The isoelectric point of the enzyme was about pH 4.5. The optimal pH and temperature for the enzyme reaction were 6.0 and $50^{\circ}C$, respectively. The purified enzyme digested inulin into di-D-fructofuranose-l, 2': 2, 3'-dianhydride, confirming the enzyme was an inulin fructotransferase (inulinase II).

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Cloning and Characterization of Cycloinulooligosaccharide Fructanotransferase (CFTase) from Bacillus polymyxa MGL21

  • Jeon, Sung-Jong;You, Dong-Ju;Kwon, Hyun-Ju;Shigenori Kanaya;Namio Kunihiro;Kim, Kwang-Hyeon;Kim, Young-Hee;Kim, Byung-Woo
    • Journal of Microbiology and Biotechnology
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    • 제12권6호
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    • pp.921-928
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    • 2002
  • Microorganism producing extracellular CFTase was isolated from soil and designated as Bacillus polymyxa MGL21. The gene encoding the CFTase (cft) from B. polymyxa MGL21 was cloned and sequenced. The ORF of the cf gene was composed of 3,999 nucleotides, encoding a protein (1,333 amino acids) with a predicted molecular mass of 149,375 Da. Sequence analysis indicated that CFTase was divided into five distinct regions. CFTase contained three regions of repeat sequences at the N-terminus and C-terminus. The endo-inulinase region of homology (ERH) of CFTase was similar to that of Pseudomonas mucidolens endo-inulinase ($50\%$ identity, 259 amino acids). Furthermore, CFTase possessed a highly conserved core region, which is considered to be functional for the hydrolysis reaction of inulin. The cft gene was expressed in a His-tagged form in Escherichia coli cells, and the His-tagged CFTase was purified to homogeneity. The optimal temperature and pH for CFTase activity were found to be $50^{\circ}C$ and 9.0, respectively. The enzyme activity was completely inhibited by 10 mM $Ag^+\;and\;Cu^2+$. Thin-layer chromatography analyses indicated that CFTase catalyzed not only the cyclization reaction ut also disproportionation and hydrolysis reactions as well.