Thermococcus pacificus P-4의 유전체 서열 분석을 통하여 예측되는 GH1 ${\beta}$-glucosidase를 암호화하는 유전자를 동정하였다. 그 유전자는 487 아미노산들을 암호화하는 1,464 bp 나타내었으며, 그 아미노산 서열은 Pyrococcus furiosus ${\beta}$-glucosidase와 77% 상동성을 나타내었다. 그 유전자는 Escherichia coli 시스템 내에서 복제 및 발현하였다. 재조합 된 단백질은 금속 친화크로마토그래피를 통하여 정제하고 특성을 분석하였다. 정제된 단백질(Tpa-Glu)은 pH 7.5와 $75^{\circ}C$에서 최적활성을 나타내었으며, 열안정성은 $90^{\circ}C$에서 약 6시간의 반감기를 보였다. Tpa-Glu는 pNP-${\beta}$-glucopyranoside, pNP-${\beta}$-galactopyranoside, pNP-${\beta}$-mannopyranoside, 그리고 pNP-${\beta}$-xylopyranoside 순으로 우수한 $k_{cat}/K_m$ 값을 나타내었다. 또한, Tpa-Glu는 ${\beta}$-1,3-linked polysaccharide (laminarin) 그리고 ${\beta}$-1,3-와 ${\beta}$-1,4-linked oligosaccharides에 대하여 exo-hydrolyzing 활성을 보였다. 본 연구는 초고온 고세균으로터 ${\beta}$-glucosidase가 exohydrolyzing 활성을 처음 확인한 것으로 이 효소는 laminarin의 당화공정에 ${\beta}$-1,3-endoglucanase와 함께 적용할 수 있을 것으로 기대된다.
Enzymatic deinking of office-waste paper was studied using crude cellulase and papain-hydrolyzed cellulase from Trichoderma reesei Rut C-30 in small-scale and mid-scale. The results were compared with deinkings using commercial enzyme(Novozym 342) and conventional chemical methods. Maximum brightness and freeness were obtained at 3 units/g Oven Dry Paper(ODP) of CMCase activity using crude cellulase in mid-scale deinking experiments. The deinked pulp had higher physical strength and brightness, and lower freeness and yield than the pulp deinked in small scale. In small scale deinking, maximum brightness and freeness were obtained at 2 unit/g ODP. Deinking by papain-hydrolyzed cellulase showed similar results with one by Novozym 342. It was better in brightness and freeness, but showed lower physical strength and yield, than the conventional deinking by sodium hydroxide. The ratio of endo-1,4-glucanase and exo-1,4-glucanase components in papain hydrolyzed cellulase from T. reesei Rut C-30 was similar to that of commercial enzyme, Novozym 342, implicating a successful application as a deinking enzyme.
Chitinase (EC 3.2.1.14) from culture fluid of Bacillus licheniformis KFB-C14 was purified 66-folds to homogenity in overall yield of 21% by ammonium sulfate fractionation, DEAE-Toyopearl, Butyl-Toyopearl and TSK-Gel HW-55F column chromatography. The enzyme protein had a molecular weight of about 86,000 and was composed of one subunit. The enzyme was significantly stable not only at high temperature but also on treatment with organic solvents and protein denaturants such as SDS, urea and guanidine-HC1. The optimum temperature and pH for reaction was 60$\circ $C and 6.0, respectively. The enzyme activity was inhibited by only Mn$^{2+}$ ion, but not inhibited by EDTA, N- ethylmaleimide and pCMB. The enzyme had high activity with colloidal chitin (V$_{max}$: 421) and commercial chitin (V$_{max}$: 480), but not with typical substrates of exo type chitinase. The thermostable chitinase had an useful reactivity for producing functional chitooligosaccharide, showing the production of (GlcNAc)$_{1}, (GlcNAc)$_{3}$, and (GlcNAc)$_{2}$ as major product.
수집한 장류 시료에서 분리한 균주들을 CMC를 함유하는 배지에 접종하여 섬유소 분해 활성이 우수한 4-1 균주를 선발하였다. 4-1 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과, B. subtilis로 동정되었다. B. subtilis 4-1의 효소생산을 위한 최적 배양조건은 탄소원으로 1.0% soluble starch와 질소원으로 0.1% yeast extract를 첨가하여 $45^{\circ}C$에서 24시간 배양하였을 때로 나타났다. 최적 배양 pH를 조사한 결과, pH 5.0~9.0에서 cellulase 효소활성이 높았다. B. subtilis 4-1의 조효소 특성은 효소반응의 최적 pH가 pH 9.0, 반응온도는 $60^{\circ}C$에서 효소활성이 가장 높았으며, $20{\sim}90^{\circ}C$ 온도에서 60분간 열처리시 효소 활성이 80%이상 유지되었다. 따라서 B. subtilis 4-1에 의해 생산되는 cellulase는 내알칼리성 효소로 추정되며, 높은 열에도 안정한 것으로 나타났다. B. subtilis 4-1이 생산하는 cellulase는 CMC에 가장 높은 효소활성을 나타내었으며 avicel과 pNPG에서도 활성을 보여 복합효소로 생각된다.
기주, 분리 연도 및 장소가 다른 Botryis cinerea 20개 균주를 이용하여 오이세포벽을 탄소원으로 첨가한 배지에서 배양한 뒤 병원성과 관련이 있는 것으로 알려진 polygalacturomase, Iaccase, $\beta$-glucosidase의 활성을 측정하고 병원성과의 상관관계를 조사하였다. 조사된 효소들의 활성과 병원성과의 상관관계는 상관계수가 모두 0.5 이하로 직접적인 연관성을 인정할 수 없었다. 그러나 Bovendamm 배지에서의 균사생장 정도의 병원성은 r=0.522(p=0.05)로 정의 상관관계를 보였다. 또한 병원성이 강한 3균주와 약한 3균주를 선발하여 각 기주의 세포벽을 첨가하여 배양 후 poly-galacturonase 활성정도를 비교하였으나 뚜렷한 경향을 찾을 수 없었다. Exo-PG 항체를 이용한 면역혈청 blotting 결과 병원성이 다른 거의 모든 균주가 66kDa 크기의 1 band를 보이는 유사한 효소 pattern을 보였다. 이상의 결과로 볼 때 측정된 이들 효소는 병원성과 관련된 일차적 요인이 아닐 것으로 생각한다.
토양으로부터 세포외 xylanase를 다량 생산하는 균주를 분리하고 분리균의 형태적 내지는 생화학적인 특성을 조사하여 Bacillus stearothermophilus No.236로 동정하였다. 본 분리균은 초기 pH가 pH 6.5 인 0.75% xylan, 0.35% yeast extract, 1.06% $K_2$HPO$_4$, 0.61% NaH$_2$PO$_4$.2$H_2O$, 0.20% (NH$_4$)$_2$SO$_4$, 0.05% MnSO$_4$ 0.07% MgSO$_4$ 0.05% CaCO$_3$의 조성을 지닌 배지에서 5$0^{\circ}C$, 28시간 진탕배양했을 때 배양액 $m\ell$당 약 0.85units로서 가장 높은 효소생산량을 나타내었다. 또 본 xylanase는 xylan에 의해 유도 생산되는 세균 xylanase로서는 그 예가 극히 드문 exo-type의 효소인 것으로 판단되었다.
The production of maltose utilizing swollen extrusion starch seems to have many technical advantages, such as, high reaction rate and high yield, production of high purity concentrated maltose, and low energy consumption, over the conventional method utilizing liquefied starch. The characteristics of maltose formation in heterogeneous enzyme reaction system comtaining swollen extrusion starch was investigated using fungal $\alpha $-amylase. The influence of extrusion conditions on structure of extruded starch, such as, degree of gelatinization, water absorption index, and water solubility index was analyzed. The relationship between the structural features and maltose forming reaction was investigated, and the result was analyzed in terms of surface reaction of insoluble extruded swollen starch. The characteristics of maltose formation from swollen sxtrusion starch was compared using endo-type fungal $\alpha $-amylase and exo-type $\beta $anylase, and the structural trasformation of extruded starch was also observed to clarify the reaction mechanism.
Two α-ʟ-arabinofuranosidases (BfdABF1 and BfdABF3) and a β-ᴅ-xylosidase (BfdXYL2) genes were cloned from Bifidobacterium dentium ATCC 27679, and functionally expressed in E. coli BL21(DE3). BfdABF1 showed the highest activity in 50 mM sodium acetate buffer at pH 5.0 and 25℃. This exo-enzyme could hydrolyze p-nitrophenyl arabinofuranoside, arabino-oligosaccharides (AOS), arabinoxylo-oligosaccharides (AXOS) such as 32-α-ʟ-arabinofuranosyl-xylobiose (A3X), and 23-α-ʟ-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), whereas hardly hydrolyzed polymeric substrates such as debranched arabinan and arabinoxylans. BfdABF1 is a typical exo-ABF with the higher specific activity on the oligomeric substrates than the polymers. It prefers to α-(1,2)-ʟ-arabinofuranosidic linkages compared to α-(1,3)-linkages. Especially, BfdABF1 could slowly hydrolyze 23,33-di-α-ʟ-arabinofuranosyl-xylotriose (A2+3XX). Meanwhile, BfdABF3 showed the highest activity in sodium acetate at pH 6.0 and 50℃, and it has the exclusively high activities on AXOS such as A3X and A2XX. BfdABF3 mainly catalyzes the removal of ʟ-arabinose side chains from various AXOS. BfdXYL2 exhibited the highest activity in sodium citrate at pH 5.0 and 55℃, and it specifically hydrolyzed p-nitrophenyl xylopyranoside and xylo-oligosaccharides (XOS). Also, BfdXYL2 could slowly hydrolyze AOS and AXOS such as A3X. Based on the detailed hydrolytic modes of action of three exo-hydrolases (BfdABF1, BfdABF3, and BfdXYL2) from Bf. dentium, their probable roles in the hemiceullose-utilization system of Bf. dentium are proposed in the present study. These intracellular exo-hydrolases can synergistically produce ʟ-arabinose and ᴅ-xylose from various AOS, XOS, and AXOS.
분쇄마찰매체 함유 효소반응계에서 순수분리된 glucoamylase 또는 $\alpha$-amylase에 의한 옥수수 생전분의 효소당화 mechanism을 규명코자, 생성된 당조성, SEM을 이용한 전분입자의 구조, 효소흡착량 그리고 amylose 함량 등의 변화를 관찰하였다. 생성당 조성은 분쇄마찰매체 효소반응계에서도 큰 변화없이 glucoamylase의 경우 반응초기부터 glucose가 주로 생성되었고, $\alpha$-amylase의 경우에는 maltopentaose (G5)를 포함한 oligosaccharide(G2-G8)가 주고 생성되었고 약간의 glucose가 포함되었으며, 당조성은 경시적으로 크게 변하지 않았다. SEM으로 전분입자의 구조를 관찰한 결과, 효소를 첨가하지 않을 경우 분쇄마찰매체의 기계적 충격은 전분입자의 구조변화에 큰 영향을 미치지는 못하였고 다만 전분입자를 균열시켰다.
To investigate production and hydrolysis of levan, the levansucrase enzymes from Zymomonas mobilis ATCC 10988 and Rahnella aquatilis ATCC 33071 were used. The optimum temperature of R. aquatilis levansucrase for levan formation was $37^{\circ}C$, whereas that of Z. mobilis was $4^{\circ}C$, under the experimental conditions. Both levansucrases also catalyzed the reverse levan hydrolysis reaction. Levan hydrolysis reactions from both levansucrases were temperature dependent; high temperature ($20^{\circ}C$) was more favorable than low temperature ($4^{\circ}C$) by 4 times. Fructose was the only product from hydrolysis reaction by both levansucrases, showing that both levansucrases mediated the hydrolysis reaction of exo-enzyme acting. In both enzymes, initial levan hydrolysis activity was almost accounted to 1% of initial levan formation activity. The results allow the estimation of the fructose release rate in enzyme processing conditions.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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