To obtain an edible grade oil from crude oil extracted from oil-bearing materials, it is generally necessary to carry out a refining process composed with degumming, deacidification, bleaching, and deodorization, to remove undesirable matters which affect the quality and shelf life of oils. The main purpose of degumming is to remove gum material mainly consisted with phospholipids. Phospholipases convert nonhydratable phospholipids into their hydratable forms which can be removed by centrifugation. In comparison with conventional water and acid degumming processes, enzymatic degumming can result the lower phosphatide content in oil than conventional processes. The enzymatic degumming can be conducted with the reduced amount of acid, and contributes to generate less amount of wastewater, decrease of operating cost, and increase oil recovery yield. The phospholipases used in enzymatic degumming process are phospholipase A1, A2, B, and C.
본 연구에서는 원료 유지로 산가 0.68 mgKOH/g, 수분 함량 0.09%, 고형물 함량 0.13%, 인 함량 40 ppm가량의 crude canola oil을 바이오디젤의 원료유로 활용하기 위하여 인 함량을 10 ppm 이하로 낮추는 탈검 공정을 수행하였다. Crude canola oil을 바이오디젤의 원료유로 사용하기 위해 수용성 탈검과 phospholipase A2를 탈검제로 하는 효소 탈검 공정을 비교하는 실험을 수행하였으며, 분석 결과를 바탕으로 바이오디젤의 원료유로써 조건을 만족시키는 탈검 방법을 선정하고 반응 조건을 확립하였다. 수용성 탈검의 경우에는 증류수 사용량 oil 대비 2 wt%, 반응온도 $30^{\circ}C$, 교반 속도 900 rpm에서 탈검 효율이 다른 조건에 비하여 높았으며, 반응 시간은 30분이 가장 효과적인 것으로 나타났다. Phospholipase A2를 탈검제로 사용하는 효소 탈검의 경우에는 인 함량결과를 보면 모든 조건에서 비슷한 탈검 효율을 나타내었다. 그리하여 산가 분석을 실시한 결과, 효소 투입량 oil 대비 90 ppm, pH 5, 반응 온도 $50^{\circ}C$에서의 탈검 효율이 다른 조건과 비해 우수하였다. 수용성 탈검과 효소 탈검을 비교해 보면, 효소 탈검이 효율이 높았으나 바이오디젤의 원료유를 생산하는 목적의 경우, 반응시간, 공정의 경제성을 고려할 때 수용성 탈검을 선택하는 것이 유리하다고 판단되었다.
비누 정련 견사와 효소 정련 견사의 결정 구조는 정련 구조 중 처리온도의 차이에 의하여 효소 정련 견사의 결정성이 비누 견사의 결정성 보다 높다고 전보(김·남, 1992)에서 보고하였는데 이와같은 정련 견사의 결정성의 차이가 정련 견사를 열처리를 하였을 때 어떻게 변화하는지를 밝히기 위하여 두가지 방법으로 정련한 견사에 대하여 습열 처리와 동결 처리한 후 특성을 분석한 결과는 다음과 같다. 1. 정련 견사를 습열 처리한 경우 강력과 신도는 모두 저하되었으며 비누 정련 견사는 습열 처리온도의 상승과 함께 열 분해 온도도 고온측으로 이동하고 IR crystallinity도 증가하였으나 효소 정련 견사는 습열 처리에 의하여 열 분해 온도와 IR crystallinity의 큰 변화가 없었다. 이와 같은 결정 구조의 차이는 비누 정련 견사는 습열 처리로 재배향 결정화가 일어나 결정화도는 증가되었으나 효소 정련 견사는 습열 처리에 의한 재배향 결정화보다 습열 처리에 의하여 팽윤되어 수축하는 과정에서 배향성이 저하되기 때문에 결정성은 더 이상 증가되지 않은 것으로 추측된다. 2. 정련 견사를 동결 처리하였을 때 강력과 신도는 약간씩 감소하는 경향이었으나 열 분해 온도와 IR crystallinity는 비누 정련 견사와 효소 정련 견사 모두 큰 변화가 없었다.
생사 및 견직물에 대한 효소정련방법을 구명하기 위한 시험 결과 1. 각종 효소정련조건이 정련효율에 비치는 영향에 있어서 정련온도 및 정련용의 산도는 Papain 7$0^{\circ}C$, pH 5-6, Trypsin 4$0^{\circ}C$ pH 8, Alkalase 50-6$0^{\circ}C$, pH 8-9에서 각각 정련효율이 가장 높았다. 2. Alkalase 처리농도가 생사의 정련효율에 미치는 영향에 있어서 처리농도가 0.6-1.0g/l 범위에서 높이면 정련시간을 단축시킬 수 있다. 3. 생사의 Alkalase정련에 있어서 정련전처리(95$^{\circ}C$, 10분 1g/l NaHCO3) 또는 정련후처리(2%, o.w.f. sodium silicate, 8$0^{\circ}C$, 20분)를 행하면 정련효율을 향상시킬 수 있었다. 4. 효소정련견사의 강력(g/d), 신도 및 라우지네스 성적은 비누 정련견사에 비하여 향상되는 경향이었다. 5. Alkalase에 의한 효소정련에 있어서 생견직물의 조련정도가 정련효율에 미치는 영향은 조련연감율이 높을수록 효소정련효율이 높았으며 205 이상에서는 하부다에 및 크\ulcorner데신 모두 완전한 정련이 가능하였다. 6. 조련연감율을 20%로 한 견포에 대하여 3종의 효소정련을 실시한 경우 Papain 및 Trypsin 정련구는 Alkalase 정련구에 비하여 정련효율이 저하되었다. 7. 효소정련견포의 강건도는 크\ulcorner데신의 경우 1.27cm로서 대조인 비누소오다 정련견포 1.53cm에 비하여 17% 저하되었고 Drape 계수는 0.297로서 비누소오다 정련견포의 0.321에 비하여 7% 감소됨으로서 유건한 촉감이 향상되었다.
견사의 정연 방법으로는 알카리 용액에서 열을 이용하는 방법과 단백질 분해 효소를 이용하는 방법으로 크게 나눌 수 있는데 본 실험은 Bacillus licheniformis 단백질 분해 효소로 정연한 견사의 이화학적 특성과 열 처리 영향 및 효소 정연 견 피브로인 수용액의 특성을 비누 정연 견사와 비교하여 실험한 결과 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 정연 견사의 표면을 주사 전자현미경으로 관찰한 결과 정연 방법에 따른 뚜렷한 차이가 없었으며 정연 견사의 아미노산 조성을 분석한 결과에서도 정연 방법에 따른 큰 차이가 없었다. 2. 효소 정연 견사는 비누 정연 견사에 비하여 강력과 신도가 약간 저하되었고 점도도 비누 정연 견사의 0.59에 비하여 효소 정연 견사는 0.56으로서 저하된 반면 ($\alpha$+$\varepsilon$) amino group content는 비누 정연견사의 49.5$\mu$mo1/g보다 효소 정연 견사는 53.6 $\mu$mol/g로서 증가되었으므로 효소 정연 견사는 비누 정연 견사보다 degradation이 더 일어난 것으로 추측된다. 3. 효소 정연 견사는 비누 정연 견사에 비하여 복굴절도가 높았으며 DSC thermogram에서 열 분해 온도도 약 1$0^{\circ}C$ 높았다. 또 효소 정연 견사의 IR 및 X-ray crystallinity도 각각 0.70과 0.53으로서 비누정연 견사의 0.67과 0.50에 비하여 약간 높았으므로 효소 정연 견사의 경우 결정성 및 배향성이 비누 정연 견사보다 높은 것으로 판단된다.
견층을 자연 건조하므로써 변성을 받지 않은 시료에 대하여 Bacillus licheniformis 단백질 분해 효소 정련과 비누 정련의 특성을 비교하기 위하여 널리 사용되고 있으며 용해할 때 비교적 피브로인에 대한 degradation이 적은 두가지 용해볍으로 용해한 견 피브로인 수용액에 대하여 분자 구조상의 차이가 있는지를 구명하고져 실험한 결과는 다음과 같다. 1. 견 피브로인 수용액의 편광 현미경으로 관찰한 결과 구정은 관찰되지 않았으나 나뭇잎 모양의 피브릴 구조가 나타났고 전자 현미경으로 관찰한 결과 구정의 크기는 30~120mm 정도였으며 정련 방법과 견 피브로인을 용해하는 방법에 따른 차이는 없었다. 2. 견 피브로인 수용액의 점도 측정 결과 비누 정련견 피브로인 수용액보다 효소 정련 견 피브로인 수용액의 intrinsic viscosity가 낮았다. 3. 견 피브로인 수용액에 대한 전기 영동 시험 결과 약 20kd에서 small submit와 50kd 이상에서 large subunit에 해당하는 폭 넓은 band가 나타났으며 정련 방법에 따른 차이는 없었다. 4. 견 피브로인 수용액을 냉동 건조한 분말에 대한 열 분해 온도는 비누 정련 견사와 효소 정련 견사간에 차이가 없었고 용해 방법에 따른 열 분해 온도는 cupric hydroxide-ethylene diamine법으로 용해하였을 때 조금 낮았다. 5. 견 피브로인 수용액을 송풍 건조한 시료에 대한 IR spectrum은 silk II형과 silk I형이 복합되어 나타났으며 정련 방법은 다른 차이가 없었다.
견직물에 효소에 의한 정련처리를 비누-소다정련과 함께 실시한 후 이들 정련견포에 대하여 KES-F System을 적용하여 역학적 특성 즉 인장, 굽힘, 전단, 압축 및 표면특성을 측정하고 태값을 산출하여 효소정련과 비누-소다정련견포의 태값을 비교한 결과 1. 능하부다이 견직물의 경우 효소정련을 하면 포의 Stiffness가 비누-소다정련을 한 것에 비하여 감소되었고 Smoothness와 Soft feeling은 증가하였다. 2. 크\ulcorner데신 견직물의 경우 효소정련을 하면 비누-소다 정련에 비하여 Stiffness와 Anti-Drape Stiffness는 감소되었으며 Fullness와 종합 태값인 Flexibility with soft feeling은 향상되었다.
정련 액에서 수용성 세리신을 얻고, 남은 난용성 세리신을 여러가지 효소로 가수분해하여, 효소 가수분해 특성을 알아보고. 아미노산 조성과 분자량을 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 효소 가수분해 시 kojizyme과 flavourzyme의 최적조건은 pH 7, 온도 5$0^{\circ}C$이었고, protamex와 alcalase는 처리 pH의 증가에 따라 활성이 높았고 최적온도는 6$0^{\circ}C$이었다. 2 효소 가수분해 시 용해도 측정에서는 효소 처리농도 증가에 따라 용해도도 높았으며, 4시간 이상의 처리에서는 아주 소폭으로 용해도가 증가하였다. 3. 효소 가수분해 시 흡광도를 이용한 용해도 측정에서는 효소 처리농도 증가에 따라 흡광도도 높았으며. 4시간 이상의 처리에서도 계속하여 흡광도가 증가하였다. 4. 효소 가수분해 시 말단기 정량에 의한 평균중합도 측정에서는 처리시간과 농도의 증가에 따라 중합도가 감소하였다. 5. 아미노산 분석 결과 정련 후 채취한 low와 high의 아미노산 조성이 비슷하고, PK와 PP및 PA의 아미노산 조성이 비슷하였으며, low와 high는 PK, PP, PA보다 세린과 타이로신의 함량이 많았고, 프롤린은 검출되지 않았다. 6. GPC에 의한 분자량 측정결과 중량평균분자량(Mw) 크기는 PK>high>PP>low>PA 순서이었으며, PK와 PA의 Mw는 각각 9,800, 905이었다
Phospholipase A2 (PLA2) from Streptomyces violaceoruber is a lipolytic enzyme used in a wide range of industrial applications including production of lysolecithins and enzymatic degumming of edible oils. We have therefore investigated expression and secretion of PLA2 in two workhorse microbes, Pichia pastoris and Escherichia coli. The PLA2 was produced to an activity of 0.517 ± 0.012 U/ml in the culture broth of the recombinant P. pastoris. On the other hand, recombinant E. coli BL21 star (DE3), overexpressing the authentic PLA2 (P-PLA2), showed activity of 17.0 ± 1.3 U/ml in the intracellular fraction and 21.7 ± 0.7 U/ml in the culture broth. The extracellular PLA2 activity obtained with the recombinant E. coli system was 3.2-fold higher than the corresponding value reached in a previous study, which employed recombinant E. coli BL21 (DE3) overexpressing codon-optimized PLA2. Finally, we observed that the extracellular PLA2 from the recombinant E. coli P-PLA2 culture was able to hydrolyze 31.1 g/l of crude soybean lecithin, an industrial substrate, to a conversion yield of approximately 95%. The newly developed E. coli-based PLA2 expression system led to extracellular production of PLA2 to a productivity of 678 U/l·h, corresponding to 157-fold higher than that obtained with the P. pastoris-based system. This study will contribute to the extracellular production of a catalytically active PLA2.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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