각종(各種) 시료(試料)로부터 1,573주(株)의 균주(菌株)를 분리(分離)하고 그 중에서 endo-polygalacturonase (Endo-PG) 활성이 강한 Aspergillus niger B-15를 선발하였다. 이어서 선정균주(選定菌株)에 자외선을 연차적(連次的)으로 조사(照射)하여 변이주(變異株) U-46을 얻었으며 친주(親株)와 변이주(變異株)의 균학적성질(菌學的性質)을 조사(調査)하고 변이주(變異株)의 효소생산조건(酵素生産條件)과 반응조건(反應條件)을 검토(檢討)하여 아래와 같은 결과를 얻었다. 1. 변이주(變異株) U-46은 친주(親株)보다 분생자두(分生子頭)의 크기가 작아지고 분생자병(分生子柄)의 길이가 짧아졌다. 2. 밀기울배지에서의 배양(培養)에 있어서 Endo-PG생산(生産)을 위한 최적조건(最適條件)은 친주(親株) B-15의 경우 밀기울에 대한 첨수량(添水量) 40%, 배양온도(培養溫度) $30{\sim}35^{\circ}C$였으나 변이주(變異株) U-46의 경우는 밀기울에 대한 첨수량(添水量) 60~70%, 배양온도(培養溫度) $35^{\circ}C$였다. 배양일수는 어느 것이나 2~3일간이 적당하였다. 3. 친주(親株)와 변이주(變異株)를 각각의 최적조건(最適條件)에서 배양(培養)할 경우 친주(親株) B-15의 Endo-PG에 비하여 변이주 U-46의 효소활성은 약 20배 높았다. 4. 밀기울배지(밀기울에 대한 첨수량(添水量) 60%)에 $35^{\circ}C$, 3일간 배양할 경우 변이주 U-46 은 친주(親株)에 비하여 Endo-PG 활성이 약 47배(倍)로, Exo-PG 활성은 약 18배로 증가되었으며 cellulase, ${\alpha}$-amylase 및 glucoamylase 활성도 증가되었다. 5. 밀기울에 $(NH_4)_2SO_4$을 1.2~1.5% 첨가(添加)한 배지에서 변이주(變異株) U-46의 Endo-PG 활성(活性)은 약 20% 증가되었다. 6. 변이주(變異株) U-46의 조효소액(粗酵素液)의 Endo-PG 반응(反應) 최적조건은 pH 4.0~4.5, $50^{\circ}C$이었다.
Acidic endo-polygalacturonases are the major part of pectinase preparations and extensively applied in the clarification of fruits juice, vegetables extracts, and wines. However, most of the reported fungal endo-polygalacturonases are active and stable under narrow pH range and low temperatures. In this study, an acidic endo-polygalacturonase (EPG4) was purified and characterized from a mutant strain of Penicillium oxalicum. The N-terminal amino acid sequence of EPG4 (ATTCTFSGSNGAASASKSQT) was different from those of reported endo-polygalacturonases. EPG4 displayed optimal pH and temperature at 5.0 and 60-70℃ towards polygalacturonic acid (PGA), respectively, and was notably stable at pH 2.2-7.0. When tested against pectins, EPG4 showed enzyme activity over a broad acidic pH range (>15.0% activity at pH 2.2-6.0 towards citrus pectin; and >26.6% activity at pH 2.2-7.0 towards apple pectin). The Km and Vmax values were determined as 1.27 mg/ml and 5,504.6 U/mg, respectively. The enzyme hydrolyzed PGA in endo-manner, releasing oligo-galacturonates from PGA, as determined by TLC. Addition of EPG4 (3.6 U/ml) significantly reduced the viscosity (by 42.4%) and increased the light transmittance (by 29.5%) of the papaya pulp, and increased the recovery (by 24.4%) of the papaya extraction. All of these properties make the enzyme a potential application in the beverage industry.
Polygalacturonase of Byssochlamys fulva was purified and characterized. Specific activity increased from 2.21 units/mg protein to 10.47 units/mg protein through $(NH_4)_2SO_4$ treatment, SephadexG-100 gel filtration, and DEAE-Sephadex ion exchange chromatography. Divalent cations, such as $Ca^{++}\;and\;Cu^{++}$, increased polygalacturonase activity greatly. Added as $10^{-3}M$ concentration, $Ca^{++}$ ion enhanced enzyme activity 9.8folds. Optimum temperature was $50^{\circ}C$ and optimum pH was 5.0. Activation energy of reaction was 8.69 Kcal/mole. Michaelis-Menten $constant(K_M)\;and\;V_{max}$ of reaction were $6.27{\times}10^{-3}mole/l\;and\;2.85{$\mu}moles/min$. Polygalacturonase of Byssochlamys fulva preferred polygalacturonic acid to pectin as substrate and was presumed as endo-type on the basis of the relationship between viscosity reduction and substrate degradation. Molecular weight of polygalacturonase was estimated as 55,000.
The endo-polygalacturonase gene (endo-pgaA) was cloned from DNA of Aspergillus niger SC323 using the cDNA synthesized by overlapping PCR, and successfully expressed in Saccharomyces cerevisiae EBY100 through fusing the α-factor signal peptide of yeast. The fulllength cDNA consists of 1,113 bp and encodes a protein of 370 amino acids with a calculated molecular mass of 38.8 kDa. After induction by galactose for 48 h, the activity of recombinant endo-PgaA in the culture supernatant can reach up to 1,448.48 U/mg. The recombinant protein was purified to homogeneity by ammonium sulfate precipitation and gel filtration column chromatography and subsequently characterized. The optimal pH and temperature of the purified recombinant enzyme were 5.0 and 50℃, respectively. The Michaelis-Menten constant (Km) and maximal velocity (Vmax) of the enzyme for pectin were 88.54 μmol/ml and 175.44 μmol/mg/min, respectively. The enzyme activity was enhanced by Ca2+, Cu2+, and Na+, and strongly inhibited by Pb2+ and Mn2+. The pectin hydrolysates were mainly galacturonic acid and other oligo-galacturonates. Therefore, these characteristics suggest that the recombinant endo-PgaA may be of potential use in the food and feed industries.
Penicillium sp. CB-20 이 생성하는 polygalacturonase의 최대 효소활성을 위한 pH는 5.0, 최적온도는 4$0^{\circ}C$였으며, 이 효소는 약산성의 pH에서 안정성을 보였고, 온도에 의한 안정성은 3$0^{\circ}C$였으며 4$0^{\circ}C$이상에서는 급격한 효소단백질의 불활성화가 진행되었다. 금속이온 중 $Mg^{++}$, $Zn^{++}$, $Ba^{++}$ 등이 활성을 촉진시켰고, Ag$^{+}$, Cu$^{++}$, Pb$^{++}$, Fe$^{+++}$, $Ca^{++}$, $Na^{++}$, Mnc 등은 효소활성을 저해하였으며, 본 균주가 생성하는 호소의 $K_m$값과 V$_{max}$값, 활성화에너지는 2.13$\times$$10^{-2}$mol/$\ell$, 104.17 $\mu$mol/min, 2,499 Kcal/mol 이었으며, pectin보다 polygalacturonic acid를 특이 적으로 분해하였다. 효소저해제 중 EDTA, DNP, $H_2O$$_2$ 등에 의해 효소활성이 제해되어 효소분자 중의 금속이 활성에 관여하며, 말단 아미노기와 histidine의 imidazole기가 효소활성에 관여함이 입증되었던 반면에 효소분자 중 SH기는 활성에 관여하지 않음을 알 수 있었다. 이 효소의 기질분해 양상을 종이 크로마토그라피로 확인한 결과 반응초기에는 monomer, dimer oligomer 등이 생성되었고 시간이 경과할수록 oligomer는 사라지고 monomer dimer 만이 생성되는 것으로 보아 endo 형인 것으로 판단되었으며, 효소의 과즙청징도 측정에서는 약 8 unit 에서 거의 청징화되었다.
Contreras-Esquivel, Juan C.;Voget, Claudio E.;Vita, Carolina E.;Espinoza-Perez, J.D.;Renard, Catherine M.G.C.
Food Science and Biotechnology
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제15권2호
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pp.163-167
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2006
Pectin was enzymatically extracted from industrial lemon pomace by using an endo-polygalacturonase from Aspergillus niger as a processing aid and compared to pectin extraction by hot hydrochloric acid. The yield of pectin was 17.6 and 20.2% with enzymatic and acidic treatments, respectively. The molecular weight distribution did not vary greatly between the samples extracted with enzyme or acid. Large differences in charge density were observed, however, when the samples were analyzed by anionic-exchange chromatography. Pectin extracted by the enzymatic treatment indicated higher charge density than that obtained by hydrochloric acid. The higher charge density could due to the presence of endogenous lemon pectinesterase, which was activated at low pH 4.5 in situ conditions during the process of enzymatic extraction, leading to low methoxylated pectin with a higher charge density.
흙으로부터 분리된 곰팡이 144주와 식품공학과에 보존하고 있는 곰팡이 60주로부터 121주가 endo-polygalacturonase의 활성을 나타냈다. 그 중 효소생산이 좋은 Aspergillus sp. A-2를 선정하여 배양생산된 효소에 관하여 연구한 결과는 다음과 같다.(중략)
토란에 존재하는 점질다당의 새로운 이용방안을 모색하기 위하여 토란으로부터 다당을 분리하여 항보체 활성을 평가하고 구조 분석을 행하였다. 토란으로부터 분리한 조다당 CE를 이온교환수지와 Sephadex G-100 column를 이용하여 정제하였고, 그 중 수율과 활성이 양호한 CE-4a를 최종 획분으로 선정하였다. 초기 면역반응에 중요한 역할을 하는 보체계에 대한 토란 다당의 활성화 여부를 측정한 결과 양성대조군인 PSK에 준하는 강력한 항보체 활성을 보였고, 시료의 농도차이를 두어 실험한 결과 농도 의존적임을 알 수 있었다. CE-4a는 분자량 약 182.4 kDa의 다당체로 구성당 조성을 확인한 결과 Man, Gal 및 GalA를 높은 비율로 함유하고 있었다. 본 당쇄의 결합양식을 규명하기 위하여 methlyation analysis를 행한 결과 CE-4a는 terminal Galp. 3-linked-Galp, 4-linked Manp, 2,4,6-linked Manp를 포함한 총 10종의 결합으로 구성되어 있었다. 또한 CE-4a의 전체구조를 추정하기 위하여 endo-α-(1→4)-polygalacturonase, exo-α-galactosidase 및 endo-β-(1→4)-mannanase를 이용한 연속 가수분해 처리 및 해석을 행하였다. 결과를 종합하면, 토란 유래 다당 CE-4a는 (1→4)-mannan 주쇄로 존재하며 주쇄인 mannose의 C(O)6 위치에서 한가닥 또는 C(O)2, C(O)6 위치에서 동시에 두가닥의 측쇄가 연결되어 존재하고, 측쇄는 주로 galacto oligo당이 측쇄로 분지된 특징이 있음을 확인할 수 있었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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