• Reproductive and Developmental Biology
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• 제32권3호
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• pp.167-173
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• 2008

Somatic cells such as oviduct epithelial cell, uterine epithelial cell, cumulus-granulosa cell and buffalo rat river cell has been used to establish an effective culture system for bovine embryos produced in in vitro. But nitric oxide (NO) metabolites secreted from somatic cells were largely arrested the development of bovine in vitro matured/ in vitro fertilized (IVM/IVF) embryos, suggesting that NO was induced the embryonic toxic substance into culture medium. The objective of this study was to investigate whether BOEC co-culture system can ameliorate the NO-mediated oxidative stress in the culture of bovine IVM/IVF embryos. Therefore, we evaluated the developmental rate of bovine IVM/IVF embryos under BOEC co-culture system in the presence or absence of sodium nitroprusside (SNP), as a NO donor, and also detected the expression of growth factor (TGF-$\beta$, EGF and IGFBP) and apoptosis (Caspase-3, Bax and Bcl-2) genes. The supplement of SNP over 5 uM was strongly inhibited blastocyst development of bovine IVM/IVF embryos than in control and 1 uM SNP group (Table 2). The developmental rates beyond morulae stages of bovine IVM/IVF embryos co-cultured with BOEC regardless of SNP supplement (40.4% in 5 uM SNP+ BOEC group and 65.1% in BOEC group) were significantly increased than those of control (35.0%) and SNP single treatment group (23.3%, p<0.05: Table 3). The transcripts of Bax and Caspase-3 genes were detected in all experiment groups (1:Isolated fresh cell (IFC), 2:Primary culture cell (PCC), 3:PCC after using the embryo culture, 4: PCC containing 5 uM SNP and 5: PCC containing 5 uM SNP after using the embryo culture), but Bcl-2 gene was not detected in IFC and PCC (Fig. 1). In the expression of growth factor genes, TGF-$\beta$ gene was found in all experimental groups, and EGF and IGFBP genes were not found in IFC and PCC (Fig. 2). These results indicate that BOEC co-culture system can increase the development beyond morula stages of bovine IVM/IVF embryos, possibly suggesting the alleviation of embryonic toxic substance like nitric oxide.

• 한국응용곤충학회지
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• 제24권3호
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• pp.141-149
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• 1985

담배나방(Heliothis assulta Guenee)의 배자 발생을 알아보기 위하여 실내에서 우화시킨 성충의 난(卵)을 이용하여 온도에 따른 배자발생기간을 조사하였으며, $25^{\circ}C$에서의 조직분화 및 기관형성과정을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 난(卵)은 적도직경 0.53mm, 높이 0.56mm인 구형이며, 표면에는 정방형(正方形)의 요철(凹凸)무늬가 있고, 난(卵)의 정부(頂部)에는 1개의 micropyle이 있었다. 2. 담배나방의 배자발생기간은 20, 25, 30, $35^{\circ}C$에서 각각 147, 81, 61, 67시간이 있으며 $35^{\circ}C$에서의 배자기 치사율이 크게 증가하였다. 3. 난(卵)의 외형(外形)은 발생이 진행됨에 따라 색깔 및 무늬의 변화가 뚜렷하였으며 발생시간에따라 특징적이었다. 4. $25^{\circ}C$에서는 배자발생이 시작된 후 14시간이 경과하면 기관형성이 일어나며, 44시간 경과 후에는 소화기관 형성이 완성되고, 80시간 후에 부화하였다. 5. 발생 초기에 난(卵)의 장축을 따라 형성된 배자는 발생시작 24시간 경과 후에는 $90^{\circ}$ 회전하고 , 이어서 배의 장축을 중심으로 $180^{\circ}$ 회전하며, 머리부분이 micropyle을 향하여 부화시까지 고정되었다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제30권3호
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• pp.175-180
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• 2006

본 연구는 융합 전 수핵란의 활성화 처리 유무와 활성화 처리 시간이 소 체세포유래 핵이식란의 체외 발육능에 미치는 영향을 검토하기 위해 수행하였다. 소 체외성숙란의 탈핵 후 체세포 핵을 이식하고 일부는 전기 융합 후 활성화를 유기하였고(pre-AC), 일부는 먼저 활성화 처리 후 융합을 실시(post-AC)하였다. 난자의 활성화는 $Ca^{2+}$-ionophore(A23187)로 처리 후 DMAP로 4시간 배양하는 방법으로 유기하였다. 핵이식란은 CR1aa액에서 9일간 배양하여 발육율을 검토하였으며, 활성화 후 30분${\sim}$2.5시간에 고정하여 confocal microscope하에서 핵형 변화를 검사하였다. 배반포기까지 발육율은 post-AC구(20.6%)가 pre-AC(15.3%)보다 다소 높게 나타났다. 또한 활성화 처리를 하여 핵이식란의 배 발달을 비교한 결과 post-AC구가 더 늦은 배 발달 속도를 나타내었다. Post-AC구를 활성화 후 30분, 2시간, 4시간으로 나누어 융합하여 발육율을 검토한 결과 발육율에 차이가 없었다. 본 연구의 결과는 수핵란의 활성화 시간에 따라 핵이식란의 발육 및 핵형이 영향을 받을 수 있음을 시사한다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제29권3호
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• pp.241-248
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• 2014

본 연구에서 생쥐 초기 배아를 이용하여 동결 보존된 배아의 생존율 또는 발달율에 영향을 미치는 요인들의 상관관계를 알아본 결과, 배아의 발달 단계에 따른 동결 - 해동 후 생존율에 있어서는 2세포기 배아가 4~8세포기 배아보다 유의하게 높았으나(p<0.01), 배 발달율에 있어서는 4~8세포기 배아가 유의하게(p<0.01), 높아 생존율과 배 발달율과는 상관관계가 없는 것으로 사료된다. 또한, 동결 보호제에 따른 배아의 생존율에 있어서는 2, 4~8세포기 배아 모두 DMSO에서 유의하게 높았으나(p<0.01), 배 발달율에 있어서는 EG가 DMSO에 비해 더 유의하게 높은 성적을 나타내어(p<0.01, p<0.05) 동해로 인한 상해가 적은 것으로 생각되어 2, 4~8세포기 배아에서 EG가 더 효과적인 동결 보호제로 사료되며, 동결 프로그램으로는 완만 동결 - 급속 해동법이 더 우수한 프로그램으로 보인다.

• 한국가축번식학회지
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• 제22권4호
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• pp.319-329
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• 1998

본 연구는 돼지 난포란의 동결시기를 결정하고자 미성숙, 성숙중, 생숙후의 3 가지 성숙단계의 난포란을 동해방지제에 노출하거나 동결, 융해하여 체외성숙율과 체외발생율을 대조구와 비교 조사하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 각각 0, 24, 44 시간 동안 성숙배양한 난포란을 동해방지제에 노출한 후 추가배양했을 때 난포란의 성숙율은 각각 45.2, 45.0, 50.3%으로 무처리구 55.0% 와 비슷하였다. 2. 각각 0, 24, 44 시간 동안 성숙배양 한 난포란을 동해방지제에 노출한 후 체외수정하고 배양했을 때 난자의 발달율은 각각 18.6, 19.7, 47.6% 로 0 시간과 24 시간에서는 무처리구 50.9% 보다 유의하게 낮은 배발달율을 나타내었으나 44 시간에서는 차이가 나타나지 않았다. 3. 각각 0, 24, 44 시간 동안 성숙배양한 난포란을 일단계 초자화동결법 (one-step vitrification)으로 추가배양했을 때 난포란의 동결, 융해 후 성숙율은 각각 4.3, 7.1, 46.7%로 무처리구 62.4% 보다 유의하게 낮은 성숙율을 나타내었다. 4. 각각 0, 24, 44 시간 동안 성숙배양한 난포란을 일단계 초자화동결법 (one-step vitrification)으로 동결, 융해 후 체외수정하고 배양했을 때 난자의 발달율은 각각 2.5, 2.4, 10.2%로 무처리구 49.6% 보다 유의하게 낮은 성숙율을 나타내었다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제34권3호
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• pp.271-274
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• 2010

This study was conducted to investigate the survival rate of frozen-thawed spermatozoa in equine by glycerol concentration and freezing speed Two stallions (1 Thoroughbred-13 year old and 1 Arab-7 year old) bred in Korea Racing authority was examined for 1 times in a couple of weeks. Semen was collected by condom method standing heated mare and were centrifuged 650 g for 15 min. and isolated the seminal plasma. Thick fraction of semen was diluted EDTA-Lactose-egg yolk diluents to 1:1 and contained in 0.5 ml straw as $6{\sim}14{\times}10^7\;cells/ml$. Final concentrations of glycerol were 3, 5 and 7% in cryopreseved diluents and added 4 times for 2 hours equilibration. For the freezing, equilibrated straws were located 3 or 5 em above $LN_2$ gas for 5 or 10 min. Survival rates of pre-frozen sperm were $65.0{\pm}13.2%$, $68.3{\pm}10.4%$, $66.7{\pm}11.5%$ and post-frozen were $53.3{\pm}23.1%$, $45.0{\pm}15.0%$, $50.0{\pm}18.0%$ in 3, 5, 7% glycerol concentration, respectively. There was no difference between glycerol concentrations. Survival rates of frozen-thawed sperm on freezing speed were $36.7{\pm}10.4%$, $40.0{\pm}7.1%$, $30.0{\pm}13.2%$ at 3 cm-5 min and $33.3{\pm}11.5%$, $31.7{\pm}2.9%$, $21.7{\pm}10.4%$ at 3 cm-10 min in 3, 5, 7% glycerol concentration, respectively. Survival rates of frozen-thawed sperm on freezing speed were $43.3{\pm}15.3%$, $32.0{\pm}17.9%$, $22.3{\pm}15.7%$ at 5cm-5 min and were $47.5{\pm}15.0%$, $43.3{\pm}12.6%$, $48.3{\pm}15.3%$ at 5cm-10 min in 3, 5, 7% glycerol concentration, respectively. There were significantly different between groups (p<0.05). These results suggest that glycerol concentration did not affect cryopreservation of stallion semen within 3~7% but freezing speed affects. In our experiment, the best cryopreservation condition was at 5 cm above $LN_2$ gas for 10 min for pre-freezing and 7% of glycerol concentration. These results lead to commercial AI with frozen-thawed stallion semen.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제35권1호
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• pp.17-22
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• 2011

This study was designed to determine the effect of electric field strength, duration and fusion buffer in fusion parameters on the rate of membrane fusion between the somatic cell and cytoplast for Korean cattle (HanWoo) somatic cell nuclear transfer (SCNT) procedure. Following electrofusion, effect of 5 or $10\;{\mu}M$ $Ca^{2+}$-ionophore of activation treatment on subsequent development was also evaluated. Cell fusion rates were significantly increased from 23.1% at 20 V/mm to 59.7% at 26 V/mm and 52.9% at 27 V/mm (p<0.05). Due to higher cytoplasmic membrane rupture or cellular lysis, overall efficiency was decreased when the strength was increased to 30 V/mm (18.5%) and 40 V/mm (6.3%) and the fusion rate was also decreased when the strength was at 25 V/mm or below. The optimal duration of electric stimulation was significantly higher in $25\;{\mu}s$ than 20 and $30\;{\mu}s$ (18.5% versus 9.3% and 6.3%, respectively, p<0.05). Two nonelectrolyte fusion buffers, Zimmermann's (0.28 M sucrose) and 0.28 M mannitol solution for cell fusion, were used for donor cell and ooplast fusion and the fusion rate was significantly higher in Zimmermann's cell fusion buffer than in 0.28 M mannitol (91.1% versus 48.4%, respectively, p<0.05). The cleavage and blastocyst formation rates of SCNT bovine embryos activated by $5\;{\mu}M$ $Ca^{2+}$-ionophore was significantly higher than the rates of the embryos activated with $10\;{\mu}M$ of $Ca^{2+}$-ionophore (70.0% versus 42.9% and 22.5% versus 14.3%, respectively; p<0.05). This result is the reverse to that of parthenotes which shows significantly higher cleavage and blastocyst rates in $10\;{\mu}M$ $Ca^{2+}$-ionophore than $5\;{\mu}M$ counterpart (65.6% versus 40.3% and 19.5% versus 9.7%, respectively; p<0.05). In conclusion, SCNT couplet fusion by single pulse of 26 V/mm for $25\;{\mu}s$ in Zimmermann's fusion buffer followed by artificial activation with $5\;{\mu}M$ $Ca^{2+}$-ionophore are suggested as optimal fusion and activation methods in Korean cattle SCNT protocol.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제28권3호
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• pp.173-179
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• 2004

본 연구는 돼지 미성숙 난포란의 유리화 동결액에 노출시 독성과 삼투압 스트레스가 가장 적은 유리화 동결액을 조사하기 위하여 실시하였으며, 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 미성숙 난포란을 EFS(40% ethylene glycol +18% ficoll +0.3 M sucrose) 용액, ES(5.5 M ethylene glycol +1.0 M sucrose) 용액, GE(10% glycerol +20% ethylene glycol) 용액에 각각 노출하고 대조구로 아무 처리하지 않은 난포란을 체외성숙하여 관찰한 체외성숙율은 ES 용액과 대조구 에서 EFS 용액과 GE 용액보다 유의적으로 높았으며(P<0.05), 유리화 동결액의 독성에 의한 난포란의 퇴화율은 대조구, ES 용액, EFS 용액, GE 용액 순으로 유의적으로 낮은 퇴화율을 나타내었다(P<0.05). 미성숙 난포란을 EFS 용액, ES용액, GE용액에 각각 노출하고 대조구로 아무 처리하지 않은 난포란을 체외성숙, 체외수정하여 관찰한 정상 수정율은 대조구가 세 종류의 유리화 동결액보다 유의적으로 높았고(P<0.05), 유리화 동결액 간에는 유의적인 차이가 없었다. 다정자 침입율과 난자당 침입한 평균 정자수는 모든 처리구간에 유의적인 차이가 없었다. 미성숙 난포란을 EFS 용액, ES 용액, GE 용액에 각각 노출하고 대조구로 아무 처리하지 않은 난포란을 체외성숙, 체외수정, 체외 배양하여 관찰한 수정 3 일째의 분할율은 ES 용액과 대조구가 EFS 용액과 GE 용액보다 유의적으로 높았으며(P<0.05), 수정 7일째의 배반포 형성율은 모든 처리구간에 유의적인 차이가 없었다. 배양기간 동안 나타난 퇴화율은 대조구가 세 가지 유리화 동결액에 비해 유의적으로 낮았고(P<0.05), ES 용액은 EFS 용액과 GE 용액보다 유의적으로 낮은 퇴화율을 나타내었다(P<0.05).

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제29권3호
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• pp.181-186
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• 2005

본 연구에서는 배양 체계(혈청 첨가 TCM199, TALP, CRlaa 및 혈청 미첨가; IVMD101, IVF100, IVMD101)가 체외수정 또는 미세주입된 수정란의 체외 발달에 미치는 효과를 검토하였다. 또한 미세주입에 사용하는 GFP유전자의 양 및 미세주입 수정란에서 형광발현 양상을 검토하였다. 체외수정된 수정란의 $\geq$ 2세포기, 8세포기 및 배반포 도달율이 미세주입 수정란에 비하여 유의하게 높았다. 혈청 미첨가 배지에서의 8세포기 발달율이 수정란의 종류에 관계없이 유의하게 높았으나(p<0.05; $ 3.3\%\;vs.\;15.5\%$ 및 $21.4\%\;vs.\;39.4\%$, respectively), 배반포 도달율은 유사한 경향이었다($2.7\%\;vs.\;2.3\%$ 및 $23.0\%\;vs.\;23.6\%$, respectively). 한편, 2ng/uL 유전자를 미세주입한 수정란의 $\geq$ 2세포기, 8세포기 및 배반포 도달율이 4 및 8ng/uL의 것에 비하여 높은 경향이었다. 미세주입 수정란의 형광발현율은 1세포기가2및 8세포기에 비하여 유의하게 높았으나(p<0.05), 4세포기 및 배반포 단계와는 차이가 없었다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제24권1호
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• pp.111-118
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• 1997

Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) recently has been utilized widely as the most successful technique to overcome the unfertilization problem in cases of severe male infertility in couples who could not be treated by conventional IVF. Recently, indications of ICSI have been extended further and more fertilized oocytes become available. Thus, it is necessary to examine the efficiency of freezing the surplus embryos obtained from ICSI. We compared the survival rate and the future outcome of cryopreserved embryos obtained either after conventional IVF or ICSI during the same period. After ICSI or IVF, five best-quality embryos from each patient were transferred in the stimulation cycle and the surplus pronuclear (PN) stage oocytes or multicellular embryos were cryopreserved by slow freezing protocol with 1,2-propanediol (PROH) as a cryoprotectant. A total of 792 embryos from ICSI trial were thawed and 65.2% (516/792) survived. The survival rates of PN stage oocyte, multicellular embryo and PN + multicellular embryo were 63.5%, 68.2%, 64.0%, respectively. After 111 transfers, 34 pregnancies were achieved, corresponding to a clinical pregnancy rate of 30.6% per transfers. We thawed 1033 embryos from IVF trials and 57.5% (594/1033) survived. In IVF cycle, the survival rates of PN stage oocyte, multicellular embryo and PN + multicellular embryo were 58.2%, 65.2%, 40.2%, respectively. Thirty eight clinical pregnancies were established after 134 transfers, corresponding to a pregnancy rate of 28.4% per transfer. The cleavage rate of thawed PN stage oocytes from ICSI trial (61.3%) was significantly higher than those from conventional IVF (53.4%). The developmental rates of good embryo (${\geqq}$ grade II) in thawed PN stage oocytes obtained from conventional IVF and ICSI were 63% and 65%, respectively. We concluded that PN stage oocytes, multicellular embryos resulting from ICSI procedure can be successfully frozen/thawed with reasonable clinical pregnancy rates comparable to those of IVF.