두충(잎, 껍질, 줄기)의 추출물이 DNCB로 감작된 4주령 BALB/c mouse 암컷에 유도된 접촉성 피부염의 억제효과를 조사하였다. 림프절, 비장 및 흉선의 무게는 두충 투여군이 DNCB 대조군보다는 낮게 나타났다. 두충 부위별 추출물을 투여한 군에서 귀의 무게는 두충 추출물의 농도가 높을수록 감소하는 경향을 보였으며, 대조군과 비교하여 무게에 함량 변화가 있었다. 두충의 부위별 추출물을 1,000 mg/kg 농도로 투여하면 귀의 무게는 대조군과 유사한 수준까지 낮아졌으며, 귀의 두께는 두충 추출물을 투여한 군에서 시간이 경과할수록 두께가 감소하는 경향을 나타내었다. MDA 함량은 DNCB 대조군과 두충 투여군을 비교하였을 경우에, 간 조직에서 차이가 나타나지 않았으나, 염증이 발생한 귀 조직에서는 차이가 나타났으며(p<0.05), NO 함량은 SW, ST 및 BT 그룹에서 염증이 억제되어 대조군과 마찬가지로 측정되지 않았다.
Allergic contact dermatitis (skin sensitization) may be caused by a wide variety of chemicals. A murine local lymph node assay (LLNA) has been developed as an alternative to guinea pig models for assessing the contact sensitization potential of chemical. This study was carried out to evaluate the skin sensitization potential for chemicals in Balb/c mice by LLNA. Contact allergen, dinitrochlorobenzene (DNCB), respiratory allergen, toluene diisocyanate (TDI) and a weak allergen, $\alpha$-hexlycinnamaldehyde (HCA) were wed as positive chemicals and irritant, sodium lauryl sulfate(SLS) also wed as a reference chemical in this study. The weights of lymph node in the mice treated with DNCB, TDI, and HCA were increased compared to vehicle control. There was a significant increase in lymph node weight of mice treated with high concentration of SLS compared to vehicle control. The stimulation index (SI) of Lymph node cell in the mice treated with DNCB, TDI, and HCA revealed over three-fold increase compared to vehicle control by $3^H$-thymidine uptake. All allergens correctly identified in this LLNA study wing Balb/c mice. These results suggest that LLNA wing Balb/c mice could be a useful method for screening the allergenic potential of chemicals. The expression of IL-2 mRNA was slightly increased in draining auricular lymph node cell of the mice treated with TDI and HCA by RT-PCR. However the IL-2 levels in DNCB and SLS of treated animals were not significantly changed.
특정 외부항원에 노출됨으로써 생기는 피부에서의 지연형 면역과민반응을 형태학적으로 조사하기위해서 시행된 본 실험은 DNCB에 의해 인위적인 알러지성 접촉피부염을 유발시킨 후 시간의 경과에 따른 피부의 일반적인 형태, 비만세포의 변화, IL-2 receptor의 변화를 관찰하였다. DNCB 2차감작 후 실시된 contact hypersensitivity assay 결과 대조군에 비해 DNCB 처리군에서는 ear swelling이 점점 증가하여 48시간에 가장 높게 측정 되었다. 피부 조직의 일반적인 형태변화도 DNCB접종 후 48시간에서 가장 심한 피부손상의 양상을 보였는데, 진피에서 림프구 aggregation의 증가, 혈관직경의 증가, 표피로의 림프구 infiltration 증가가 일어났다. Semithin section을 통해 관찰된 DNCB처리군의 미세구조의 변화는 표피세포질내 액포화의 증가와 세포사이공간의 확장이었다. 진피에서 비만세포 수가 증가되었으며, 그 형태는 분비과립을 함유하고 있는 degranulated type으로 나타났다. 피부 진피에서 IL-2 receptor 양성반응세포수가 증가되었으며, 표피로 infltration된 IL-2 receptor 양성반응세포가 48시간에서 가장 많이 나타났다. 이상의 결과로 미루어 DNCB 감작에 의해 세포성면역과민반응이 일어나며, 이후 면역관여세포들의 복합적인 작용에 의해 급격한 염증반응이 일어나게 된다.
본 연구에서는 대두 추출물인 LES가 DNCB에 의해 인위적으로 접촉피부염을 유발시킨 랫드의 피부 회복능에 미치는 효과를 조사하였다. 알레르기 접촉피부염이 유발된 피부에 LES 17.6 mg/ml를 3-5회 도포하여 피부 표면을 조직학적 분석하여 본 결과 각질이 제거된 깨끗하고 매끄러운 상태로 되었으며, 비후화된 표피층의 두께도 점차 정상군과 같은 두께로 회복시키는 효과를 나타냈다. 또한 LES는 체내 지질함량을 낮춰 정상수준으로 회복시키는 지질함량의 개선에 효과적으로 작용하고 있으며, 혈장 내 IgE의 수준도 정상군 수준으로 감소시키고 있으며, LES에 의해 염증 반응과 관련된 iNOS와 COX-2의 활성도 감소되어 피부의 과민반응 해소에 관여하는 것으로 생각된다. LES에 포함된 주 성분 중 하나인 lunasin은 세포 침투와 함께 핵 내로 이동하는 것으로 확인되어 전체 유전자 또는 일부 유전자의 발현을 조절하는 데 관여할 것으로 추측된다. 이러한 결과로 보아 LES는 알레르기성 접촉피부염에 매우 효과적인 치료 효과를 나타내고 있기 때문에 기존의 알레르기성 접촉피부염 치료제를 대체할 수 있는 제제로서 응용이 기대된다.
Allergic contact dermatitis is a common skin disease resulting from specific immunologic to topically applied various allergen. After Dinitrochlorobenzene (DNCB) secondary sensitization, the ICR mice administered Rhemanniae radix extract (RRE) was observed to ascerstain the effect of RRE on allergic contact dermatitis. Purpose of this study was to investigate contact hypersensitivity assay, abdominal skin morphologic changes. Including mast cells and cell-surface glycoconjugates. The change of interleukin 2 (IL-2) receptor (CD25R). ICAM in abdominal skin, lymph node of inguinal region, and electro microscope-morphologic changes of abdominal skin. The results of this study were as follows: 1. The contact hypersensitivity assay, the ear swelling in the RRE had lesser probability than in the ACD Group. 2. In the general morphologic change of skin, hyperplasia of keratinocytes, distribution of vasculogenesis and epidermal lymphocytes infiltration were decreased in the RRE group compared with the ACD group. In epidermal basal layer and prickle layer, cell damage was decreased in the RRE group compared with the group painted with ACD. 3. MasT-cell in dermis was decreased in the RRE group compared with the group painted with DNCB. 4. Distribution of interlukin-2 Receptior positive cell and ICAM positive cell in dermis was decreased in the RRE Group compared with the ACD group. 5. Distribution of helper T-lymphocyte and cytotoxic T-lymphocite in inguinal nodes was decreased in the RRE group, and was observed well in paracortical area and cortical cord. 6. Distribution of apoptotic cell was appeared in the RRE group compared with the ACD group, in skin, dermis. in inguinal nodes, paracortical area observed well. With above results, the restarint of immunosuppression occuring in Allergic contact dermatitis is resulted in the slow progress the effect of Allergic contact dermatitis, and it is thought that ithis fact has a series of relation with apoptosis.
Predictive tests for the identification of contact sensitizing chemicals have been developed. We measured the sensitization potential with three predictive tests, the in vitro and the in vivo Local Lymph Node Assay(LLNA), ELISA to detect interferon-gamma(IFN-${\gamma}$) from supernatant and flow cytometry to detect change of cell surface proteins, using draining lymph nodes of mice. BALB/c mice were exposed to various chemicals or vehicles on the ears daily for 3 consecutive days in all experiments. With some exceptions of propyl paraben, neomycin sulfate, the in vivo LLNA was able to detect the sensitizing capacity of test chemicals and was more sensitive than the in vitro LLNA for chemicals used in the present study. In another experiment, contact sensitivity was assessed by the ELISA to detect IFN-Υ from the supernatants of the cultured LNCs after sensitization with chemicals. There was a good correlation between the LLNA and the IFN-Υ production for test chemicals. We also examined the change of cell surface proteins on LNCs after sensitization by flow cytometry for some cell adhesion molecules(ICAM-1, E-cadherine, B7 molecule), T cell markers(CD3, CD4, CD8, T$\alpha$$\beta$,T${\gamma}$$\delta$) and B cell markers(LR1, CD45R, I-Ad). The number of ICAM-1 positive cells and B cells in LNCs were increased after sensitization with DNCB, TNCB, isoeugenol and 25%, 50% cinnamic aldehyde compared with that of vehicle as a control. In conclusion, the in vivo LLNA could provide more sensitive screening test for moderate to strong sensitizers and some weak sensitizers including cosmetic raw materials than the in vitro LLNA. The production of IFN-Υ by allergen-activated LNCs might be a values indicators without radioisotopes for the identification of contact allergens. Detection of allergens by testing the increase of ICAM-1 positive cells and B cells in LNCs by flow cytometry might be used as a test method to detect allergens.
본 연구에서는 밤나무 과실의 속껍질인 율피를 이용하여 알레르기성 피부질환 기능성 원료로 사용 가능성을 조사하였다. 율피 열수추출물과 율피 발효추출물의 총 폴리페놀 함량은 1 mg/mL에서 각각 $73.85{\pm}1.78$, $81.32{\pm}1.73{\mu}g/mL$였으며, 동일한 농도에서 총 플라보노이드 함량은 $18.72{\pm}0.20$, $14.70{\pm}0.21{\mu}g/mL$로 나타났다. 항산화 활성으로 율피 열수 추출물과 율피 발효추출물의 전자공여능은 1 mg/mL에서 각각 $73.74{\pm}1.18$, $67.17{\pm}1.87%$로 나타났으며, superoxide anion radical 소거능은 동일한 농도에서 각각 $91.58{\pm}2.51$, $100.15{\pm}4.30%$로 두 그룹 간 항산화 활성은 큰 차이를 보이지 않았다. HS68 세포를 대상으로 율피 열수추출물과 율피 발효추출물에 대한 세포 독성을 조사 한 결과, 율피 발효추출물에서 율피 추출물과 비교 시 세포 생존율이 1.33배 증가하였다. 또한 LPS로 유도된 RAW264.7 대식세포에서 0.05 mg/mL 율피 열수추출물과 율피 발효추출물 처리에 의한 NO생산량은 각각 $36.27{\pm}4.52$, $29.56{\pm}4.91{\mu}M$로 율피 발효 추출물 처리군에서 항염증 활성이 유의적으로 높았다. 아토피 유발 NC/Nga 마우스 모델에서 율피 열수추출물 및 율피 발효추출물을 도포하여 육안 상 관찰한 피부 병변은 율피 열수추출물 처리군에서 대조군과 비교해 피부 형태학적으로 일부 호전되는 경향을 보였으나, 율피 발효추출물 처리군은 멜라닌 함량과 피부 홍반의 감소 등 뚜렷한 개선효과를 보였으며 정상군과 유사한 피부 형태를 나타내었다. 또한 피부에 존재하는 염증성 사이토카인인 IL-$1{\beta}$와 TNF-${\alpha}$의 발현이 율피 열수추출물과 비교 시 율피 발효추출물에서는 각각 13.68, 3.63% 억제되었다. 이는 in vitro 실험과 유사하게 염증과 관련된 유전자의 발현을 저해함으로써 율피 발효추출물이 염증억제 효과는 물론 항아토피 효능을 나타내는 것으로 여겨진다. 따라서 율피 열수추출물 뿐만 아니라 율피 발효추출물 역시 아토피 피부질환을 개선하는데 유용한 물질로 활용될 수 있는 효과적인 조성물이라 사료된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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