• 미생물학회지
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• 제25권1호
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• pp.40-45
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• 1987

B Brevibacterium divaricatum FERM 5948 균주로부터 Bdi I RIM 체계에 속하는 BdiI methylase 유천자를 클로닝하여 발현을 조사하였다. Bdi I methylase 유전자의 클로닝을 위해 pBR 322의 EcoRI, BamHl, Sal I 3 군데의 클로닝 site를 이 용했고 1 차 형질전환후 나온 플라스미드를 BdiI으로 자른 뒤 ligation 시키지 않고 형질전환시키는 방법을 이용하였다. 유전 자을 가지는 행질전환체의 선별은 Bdi I methylase에 의해 수정된 채조합 플라스미드는 BdiI 제한효소에 방호된다는 것에 기 초하여 선별하였는데 5.6kb의 EcoRI insert DNA를 가지는 pBDIM 116이 Bdil methylase 유전자플 가지는 것으로 판명 되었다. pBDIM 11&을 가지는 숙주셰포에서 추출한 추출용액에는 S-adenosylmethionine이 있으면 BdiI의 인지부위인 A ATCGAT에만 특정한 methylase 활성이 측정되였다. 11개의 제한효소를 이용하이 제한효소지도를 작성하였고, BdiI r restriction -modification 체계에 관해서 도 논의하였다.

• 미생물학회지
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• 제38권3호
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• pp.153-161
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• 2002

Sox4는 DNA 결합 도메인인 HMG-box와 전사 활성 도메인인 serine rich region (SRR)과 아직 그 기능이 알려져 있지 않은 glycine rich region (GRR)등의 세 개의 기능 도메인을 가지는 전사인자이다. 전사인자인 Sox4는 생체 내 초기 분화 시 중요한 역할을 하는 유전자로 알려져 있으나 여전히 그 정확한 생리적 기능 및 세포 내에서 이 유전자 산물이 전사 활성 에 어떻게 관여하는지 그 정확한 기전은 잘 밝혀져 있지 않다. 이에 본 연구에서는 Sox4의 생리적 기능을 이해하고 세포 내에서 Sox4의 기능 연구에 유용하게 사용할 수 있는 항체를 제조하기 위해 Sox4를 대장균에서 발현, 정제하였다. 모든 기능 도메인을 다 포함하는 Sox4는 대장균에서 발현 시 대부분 절단되는 양상을 나타내었다. Sox4의 각 도메인을 대장균에서 GST-융합 단백질로 발현, 정제하여 그 발현 양상을 비교해 본 바 N-말단을 제거한 Sox4 ($\Delta$HMG)의 경우 67 kDa 크기의 단백질이 생성되므로 이 단백질을 항원으로 이용하여 Sox4의 GRR에 특이적으로 반응하는 항체를 제조하였다. 또한, 67 kDa 크기의 단백질 외에 34 kDa 크기에서 GST-융합 단백질이 관찰되었다. 이 밴드는 Sox4 (GRR)를 발현, 정제시에도 관찰되는 동일한 크기의 밴드이며 thrombin과의 반응을 통해 7 kDa 크기로 절단되는 Sox4 밴드이다. 그러므로 이 들 결과로부터 GRR 내에 단백질 분해효소의 표적 부위가 존재함을 확인할 수 있었다. 본 연구결과는 아직 그 기능이 밝혀져 있는 않은 Sox4의 새로운 도메인인 GRR이 단백질 분해 효소의 표적 부위로 작용하여 Sox4의 안정성을 조절함으로써 Sox4의 활성에 중요한 역할을 수행할 수 있다는 가능성을 제시하고 있다.은 억제 회복 효과는 $Mg^{2+}$에 의한 리보자임의 td intron 구조적 안정성에 기인하는 것으로 추정된다.력이 뛰어난(adaptable) 인간적 요구사항을 충족시켜야 한다. 셋째, 다이내믹 시미트리는 역(逆, reciprocity)의 원리와 보상(補賞, complement)의 원리를 제 1의 구성원리로 하며 공간에서 서로에 대한 역과 공통성(common property)을 갖고 자기유사를 지닐 때 연속체(continuum)를 손상하지 않고 전체공간을 유기체적으로 분절한다.같은 pattern 이었다. 그러나 JR89주에서는 280kb 가 나타나지 않아 다른 분리균주와 구분되었다.과 밀가루국(麴) 사이에 차(差)가 별(別)로 없었다.果)에서 총지질(總脂質)을 구성(構咸)하는 지방산(脂肪酸) 조성(組成)은 $C_{18:2}$산(酸), $C_{16:0}$산(酸)의 순(順)으로 그 함량(含最)이 맞은데 비(比)하여 각획분(各劃分)의 지질(脂質)을 구성(構成)하는 지방산(脂肪酸) 조성(組成)은 $C_{16:0}$산(酸), $C_{18:2}$산(酸)의 순(順)으로 그 함량(含量)이 많은 것으로 나타났으며 동결건조후(凍結乾燥後) 저장(貯藏)하는 동안에$C_{18:2}$산(酸), $C_{18:3}$산(酸)의 함량(含量)이 계속(繼續) 감소(減少)하고 있었다. 5. 4-monomethylsterol fraction에는 cycloartenol(20.6%)이 비교적(比較的) 높은 함량(含量)으로 함유(含有)되어 있었고, 그 외(外) cyclolaudenol, cycloeucalenol 및 citrostadienol 등이 함유(含有)되어 있었다. 6. 4-desmethylsterol fraction에

• Radiation Oncology Journal
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• 제20권4호
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• pp.367-374
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• 2002

목적 : 인체 대장암 세포주인 HT-29에 새로운 CDCA 합성유도체인 HS-1200을 처치하여 암세포의 증식에 미치는 영향과 아포토시스 유도 활성을 관찰하고 기전을 연구하고자 하였다. 대상 및 방법 : 지수증식기의 HT-29 세포에 다양한 농도의 CDCA 합성유도체인 HS-1200을 투약하여 $IC_{50}$를 구하였다. $IC_{50}$의 농도를 참조하여, 세포 생존능의 실험은 frypan blue exclusion assay를 이용하였고, 아포토시스 유도에 관한 관찰 실험은 agarose gel electrophoresis, TUNEL assay 및 Hoechst staining을 이용하였다. Western blotting을 통한 PARP [poly (ADP-ribose) polymerasel, caspase-3 및 DFF (DNA fragmentation factor)의 degradation 및 cleavage 등을 관찰하였다. Immunofluorescent method를 통한 cytochrome c 방출 측정 및 미토콘드리아 막전위 측정을 실시하였다. 결과 : HS-1200은 agarose gel electrophoresis 실험에서 DNA ladder의 관찰, TUNEL assay 및 Hoechst staining 에서 아포토시스 세포들이 대량으로 관찰되는 결과로 미루어 아포토시스에 의한 세포 사망을 유도하는 것으로 사료되었다. 아포토시스에 의한 세포 사망을 검증하기 위한 Western blotting을 통한 PARP cleavage, caspase-3 및 DFF 발현 관찰에서 공히 HS-1200 처치 후 4시간 째부터 PARP, caspase-3 및 DFF의 degradation 및 cleavage가 관찰되었다. HS-1200의 아포토시스 유도에 이르는 기전연구에서 미토콘드리아의 역할에 주목하고 시행한 cytochrome c 방출 측정 및 미토콘드리아막 전위 $(\Delta\Psi_m)$ 측정에서 공히 cytochrome c 방출 및 미토콘드리아막 전위 $(\Delta\Psi_m)$의 감소가 관찰되었다. 결론 : 인체 대장암 세포주(HT-29)에서 CDCA 합성유도체인 HS-1200을 이용한 세포 증식억제 및 세포사망 기전 연구에서, 아포토시스의 유도가 HS-1200의 세포 사망 기전에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다. 이러한 아포토시스의 유도에는 미토콘드리아의 역할이 중요하게 관련되는 것으로 관찰되었다. 상기 결과를 토대로 HS-1200의 항암 치료제로서의 역할에 관한 기초 자료로 서의 유용성을 제시할 수 있었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제37권1호
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• pp.56-63
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• 1994

오이모자이크 바이러스(CMV)의 외피단백질 유전자의 일정한 염기서열을 보유하는 부분과 CMV RNA에 대항한 헤머헤드(hammerhead) 구조의 ribozyme을 만드는 올리고뉴클 레오타이드(oligonucleotide, nt)를 DNA 합성기를 이용하여 제조하였다. 올리고뉴클레오타이드의 양쪽가닥을 서로 합친 후 제한효소 BamHl과 SacI으로 처리하여 플라스미드 pBS SK(+)에 삽입하였고 CMV 기질과 ribozyme 클론의 염기서열을 결정하여 확인하였다. 기질과 ribozyme 클론 $1\;{\mu}g$ BssHII이나 SspI으로 처리한후 T7 RNA 합성효소를 이용하여 튜브내에서 전사반응을 실시하였다. 제한효소 BssHII를 처리한 경우 만들어진 기질 RNA의 크기는 176 nt 였는데 50 nt의 CMV RNA 염기, 6 nt의 Xbal 제한효소 염기, 120 nt의 벡터에서 비롯된 염기를 포함한다. Ribozyme RNA의 크기는 164 nt인데 38 nt의 ribozyme 염기부분과 그외는 기질의 것과 같은 염기를 포함한다. CMV 기질 RNA는 ribozyme RNA에 의하여 특이적으로 절단되어 96 nt와 80 nt 두개의 조각을 만들었다. 이러한 특이적 절반은$37^{\circ}C$ 보다 $55^{\circ}C$에서 더 빠르게 일어났다. SspI으로 처리한 경우 만들어진 기질 RNA(2234 nt)도 역시 위치 ribozyme에 의해 두조각으로 절반되었으며 SspI 처리 후 만들어진 ribozyme RNA(2222 nt)에 의해서 특이적으로 절단되었다.

• 한국식품과학회지
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• 제44권3호
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• pp.317-323
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• 2012

재배 와송의 항암효과를 입증하기 위해 SW480 대장암세포에서 재배 와송 추출물의 apoptosis 유도 효과 및 그 기전에 미치는 영향에 대해 알아보았다. 재배 와송과 천연 와송 메탄올 추출물의 암세포 성장 억제능을 측정한 결과, 재배 와송은 천연 와송과 유사하게 농도 의존적으로 높은 암세포 증식억제효과를 보였으며 특히 농도 300 ${\mu}g$/mL의 재배 와송 메탄올 추출물에서는 천연 와송 메탄올 추출물 보다 더 높은 억제 효과를 나타내었다. 또한 재배 와송 메탄올 추출물을 분획하여 얻은 각각의 물, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물 중 와송 클로로포름 분획물에서 암세포의 증식 억제효과가 가장 높게 나타났다. 이러한 와송 클로로포름 분획물의 apoptosis 유도 효과는 Sub-G1기의 함량 증가와 핵의 응축 및 apoptotic bodies 생성 그리고 DNA 분절을 통해 나타났다. 한편, 와송 클로로포름 분획물의 caspase 활성은 caspase inhibitor 처리군에서 암세포의 증식 억제효과가 확연히 저해됨을 나타내었으며 각각의 caspase 활성 중 caspase-3 및 -9의 활성을 증가시켰다. 또한 와송 클로로포름 분획물은 apoptosis 관련 단백질들인 Bid, Bcl-2 및 PARP의 발현을 농도 의존적으로 감소시켰으며 tBid 및 Bax 단백질의 발현을 현저하게 증가시켰다. 본 연구 결과, 재배 와송과 천연 와송은 유사한 암세포 성장 억제 효과를 보였으며 재배 와송의 클로로포름 추출물은 caspase 의존적인 경로를 통해 apoptosis를 일으켜 세포 사멸 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

• 한국가축번식학회지
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• 제25권4호
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• pp.399-407
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• 2001

MII단계 난자의 위란강에 retroviral vector를 주입하여, 형질전환 난자의 생산하려는 연구가 수행되고 있다. 그러나 이러한 난자의 위란강의 크기는 매우 다양하므로, 외래유전자를 위란강에 미세주입을 할 때, 난자의 세포질에 손상을 줄 수가 있다. 이에 본 연구에서는 외래유전자 주입시 발생할 수 있는 난자세포의 손상을 최소화하기 위하여 sucrose처리법을 채택하였다. 즉 난자를 0.5%의 sucrose가 첨가된 배양액으로 처리함으로써 일정한 형태의 세포질을 유지하지 못하는 난자와 일정한 형태의 세포질을 유지하는 난자로 분류할 수 있었으며, 후자의 경우 세포질의 큰 손상 없이 retroviral vector를 난자의 위란강내에 주입할 수 있었다. 그러나 sucrose처리에 의해 선별된 난자의 수정율과 대조군의 그것 사이에는 유의차가 없었다. 또 sucrose처리에 의해 선발된 난자에 있어서 retroviral vector (LN$\beta$-EGFP and LNC-hGH) 주입 후의 분할율과 배반포발달율 같은 양상을 보였다. LN$\beta$-EGFP이 주입된 경우, 분할율과 배반포율이 81 및 25% 보였으며, LNC-hGH이 주입된 경우, 83 및 30%를 보였다. 그 결과 미세주입된 난자는 대조군과 유의적인 차이 없이 발달할 수 있었다. 게다가, hGH-gene의 결합율이 PCR 분석에 의하여 분할된 난자에서 52%를 보였으며, 또한 EGFP-gene의 발현율이 현광현미경을 총해 배반포난자 에서 34%가 관찰되었다. 이상의 결과를 종합할 매, 0.5%의 sucrose처리는 우량난자의 선발을 가능하게 하였으며, 주입유전자의 발현율이 낮아지지 않았을 뿐만 아니라, 외래유전자의 위란강내 주입시 난자에 대한 물리적 손상을 줄일 수 있으므로 발달율을 개선할 수 있는 것으로 사료된다.

• 고려인삼학회:학술대회논문집
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• 고려인삼학회 1998년도 Advances in Ginseng Research - Proceedings of the 7th International Symposium on Ginseng -
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• pp.231-243
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• 1998

In the present study, we provide evidence that ginsenoside $Rh_2$ (G-$Rh_2$) as well as staurosporine induces apoptosis of human hepatoma SK-HEP-1 cells by caspase 3-mediated processing of $p21^{WAFI/CIPI}$ in the early stage of apoptosls. Immunoblottings showed that G-$Rh_2$ as well as statrosporine induced the processing of caspase-3 to an active form, pl7. In stable Bcl-2 transfectants however, G-$Rh_2$ induced DNA fragmentation, while staurosporine did not. In the early stage of apoptosis, $p21^{WAFI/CIPI}$ was detected to undergo proteolytic processing specifically conducted by caspase-3. $p21^{WAFI/CIPI}$ translated in vitro was cleaved into a p14 fragment, when incubated with cell extracts obtained from either G-$Rh_2$- or staurosporine-treated cells. Cleavage was equally inhibited in both cases by adding Ac-DEVD-cho, a specific caspase-3 inhibitor, but not by Ac-YVkD-cho, a specific caspase-l inhibitor. Similarly, $p21^{WAFI/CIPI}$ was efficiently leaved by recombinant caspase-3 overexpressed in E. coli. Moreover, the endogenous $p21^{WAFI/CIPI}$ of untreated-cell extracts was also cleaved by recombinant caspase-3. Mutation analysis allowed identification of two caspase-3 cleavage sites, $DHVD^{112}$/L and $SMTD^{149}$/F, which are located within, or near the interaction domains for cyclins, Cdks, and PCNA. Taken together, these results show that G-$Rh_2$ as well as staurosporine increases caspase-3 activity, which in turn directly cleaves $p21^{WAFI/CIPI}$ resulting in elevation of Cdk kinase activity in the early stages of apoptosis. We propose that proteolytic cleavage of $p21^{WAFI/CIPI}$ is a functionally relevant event that allows unleashing the cyclin/Cdk activity from the inhibitor seen in the earlier stage of apoptosis, the event of which may be associated with the triggering mechanism for the execution of apoptosis.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.61-61
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• 2001

The main goal of this study was to produce transgenic piglets by the method of injection of sperm-mediated exogenous DNA. Spermatozoa (1$\times$106 sperm of final concentration) obtained from caudal epididymis were mixed with pBC1-hEPO (20 ng/${mu}ell$) or pcDNA3 LAC Z (20 ng/${mu}ell$), and followed by electroporation (500 V, 25 ㎌). Matured oocytes having the first polar body and dense cytoplasm were selected and centrifuged at 12,000g for 6 min. After sperm injection, the oocytes were activated electrically (1.7 ㎸/cm, 30 $\mu$ sec, single pulse) in 0.3 M mannitol solution. Eggs injected sperm were cultured in NCSU 23 medium (0.4% BSA) at 39$^{\circ}C$, 5% $CO_2$ in air for 192 h. This study were comprised 3 experiments. Experiment 1 compared the developmental efficiencies between the sperm-injected oocytes (Group 1) and further activated electrically (Group 2). Experiment 2 compared the expression of pcDNA3 LAC Z in the embryos produced by Group 1 and Group 2. Finally, experiment 3 carried out transfer of embryos (1-8 cell stage) transfected with pBC1 -hEPO into surrogate recipients synchronized by injection of combination of PG600 with hCG. The rates of cleavage and development into blastocyst stage in Group 2 were significantly higher than those of Group 1 (71.3% and 28.1% vs. 43.3% and 10.3%, respectively, p<0.05). Thirty (24.2%) out of 124 embryos analyzed in Group 2 were positive by X-gal. Similarly, in Group 1, 16.3% (8/49) were positive. After transfer of 789 embryos to 7 recipient gilts, three out of them examined by ultrasound became pregnant. One recipient is in day 50 pregnancy. On day 54 of gestation, two were carried out uterotomy in order to confirm the pregnancy One had 7 and another had 2 fetuses. We conclude that injection of sperm-mediated gene transfer will be used as a valuable tool for the production of transgenic piglets.

• 대한수의학회지
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• 제49권1호
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• pp.45-57
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• 2009

The molecular genetic characterization of Aujeszky's disease virus (ADV) Yangsan strain (ADVYS), a Korean isolate, was investigated by analyzing the electrophoresis patterns and the physical maps of the viral DNA digested with various endonucleases. To establish DNA library for ADV-YS, twelve major BamHI restricted segments were cloned. Each location of the segments in the ADV genome was determined by sequence comparison with the sequences reported in Genbank and those sequences of the both termini of the segments. Physical maps were constructed based on the electrophoresis patterns of the digested viral DNA by restriction endonuclease and the results of Southern blot analyses with various DIG labeled probes originated from those of enzyme restricted segments of virulent (Shope) and avirulent (Bartha) strain. Comparing ADV-YS with a standard strain of Kaplan in the maps of restriction enzymes, following major respects were identified: (i) disappearance of BamHI restriction site between the first and second BamHI segments, (ii) creation of the BamHI restriction site in the fifth segment, and (iii) generation of the BglII site in the unique short (US) region. The genome of ADV-YS also contains a type 2 herpesvirus DNA molecule (in which the US region only inverts itself relative to the unique longregion) like all other ADV strains except Norden strain(type3), analyzed up to date. The size of the ADV genome estimated from the sizes of the restriction enzyme fragments, was approximately 145.3 kb (BamHI) or 145.4 kb (BglII). BamHI enzyme cleavage patterns were compared among the five Korean ADV isolates: Yangsan, Yongin, Dangjin, Jincheon and Iksan strains. Difference either in the number or in the size of the DNA fragments, suspected regions of termini of IR and TR, could be detected among all five strains.

• Applied Biological Chemistry
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• 제39권6호
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• pp.472-476
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• 1996

P.putida NCIMB 9869와 P. putida NCIMB 9866의 분해 plasmid pRA 4000과 pRA500으로부터 p-cresol mothylhydroxylase(PCMH)의 flavoprotein(pchF) 및 cytochrome(pCHC) subunit의 구조유전자를 sequencing하였다. 이 두개의 유전자의 DNA 및 아미노산의 염기 서열은 이미 발표를 하였다. 이 두 개의 유전자 이외에도 aldehyde dehydrogenase 유전자가 확인되었다. 이 aldehyde dehydrogenase는 p-hydroxybezaldehyde를 p-hydroxybenzonate로 전환시키는데 p-hydroxybezaldehyde는 P-cresol의 PCMH에 의한 분해 산물이다. 그 외에도 P. putida 9869의 protocatechuate 3,4-dioxigenase의 alpha(pcaG) 및 beta(pcaH) subunit 가 확인되었다. 반면에 P. putida 9866는 상응하는 영역에 이 유전자들을 가지고 있지 않았다(protocatechuate는 p-hydroxyben-zonate hydroxylase에 의해 p-hydroxybenzonate로부터 생성된다). pchC와 pchF사이에 open reading frame이 존재하며 9866로 부터는 추가로 다른 하나의 open reading frame (ORF')가 존재한다. 9869과 9866의 유전자 구조는 각각 dhal-pchC-ORF-pchF-pcaGH과 ORF'-dhal-pchC-ORF-pchF다.