• 대한생식의학회:학술대회논문집
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• 대한불임학회 2001년도 제2차 연수강좌
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• pp.195-205
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• 2001

태반 영양배엽 (trophoblast)은 포유동물의 발생과정 중 가장 먼저 분화되는 세포로서, 자궁환경내에서 배아가 착상, 발생, 및 분화하기 위해서 반드시 필요한 태반을 형성하는 색심적인 세포이다. 영양배엽 세포의 분화과정중의 결함은 배아의 사산이나 임신질환 등의 치명적 결과를 초래한다. 하지만, 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 분자생물학적인 메카니즘은 아직 규명되지 않고 있다. 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 경로를 규경하기 위한 선결과제는 분화된 영양배엽 세포에서만 발현하는 많은 유전자들이 밝혀져야만 한다. 본 연구팀은 최근에 분화된 영양배엽 세포에서만 발현하는 두 종류의 새로운 유전자들을 찾았다. 한 종류는 homeobox를 보유하고 있는 조절 유전자 Psx이고, 다른 한 종류는 임신호르몬인 태반 프로락틴 라이크 단백질 유전자 PLP-C${\beta}$이다. 본 연구과제의 목표는 이들 유전자의 기능과 조절 메카니즘을 규명함으로써, 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 조절경로를 밝히는 것이다. 이를 위하여 다음과 같은 일련의 연구를 수행할 것이다. 1) Psx 유전자가 분화된 영양배엽 세포에서만 발현케 하는 조절 메카니즘을 규명하기 위해 functional assays, in vitro footprinting, gel mobility shift assays, 생쥐형질전화, UV crosslinking, Southwestern blot 등의 방법을 통해 Psx 유전자의 cis-acting 요인과 trans-acting factor를 밝혀 분석한다. 2) 영양배엽 세포의 분화조절 경로를 규명하기 위해 random oligonuclotide library screening, DD-PCR, subtractive screening 등의 방법을 이용하여 Psx 유전자에 의해 조절되는 하부유전자를 밝힌다. 3) Psx 유전자를 knock-out시켜 영양배엽 세포가 발달 및 분화하는데 미치는 역할을 밝힌다. 4) Yeast two-hybrid screening방법을 이용하여 태반 프로락틴 유전자의 수용체를 찾아 이들의 신호전달 기전을 밝힌다. 제1차년 연구결과로서, mouse와 rat으로부터 각각 Psx 유전자의 genomic DNA를 클로닝하여, 유전자 구조를 비교한 결과, mouse Psx (mPsx2)는 4개의 exons으로 이루어져 있는 반면에, rat Psx (Psx3)는 3개의 exons으로 구성되어 있었다. 즉, rPsx3는 mPsx2의 exon1이 없었다. Notrhern blot과 in situ hybridization 분석에 의해 mouse와 rat에서 Psx 유전자가 다르게 발현 조절되는 현상을 밝혔다. 실제로 mPsx2와 rPsx3의 5'-flanking지역을 클로닝하여 염기서열 분석 결과 전혀 homology를 찾을 수 없었다. 또한, 이들 각각 promoter의 activity를 luciferase reporter를 이용하여 조사한 결과 Rcho-1 trophoblast cells에서 각기 다른 activity를 보여 주는 것을 발견하였다. Psx 유전자의 transcription start sites는 Primer extension에 의해 밝혔다. 또한 Psx2 유전자를 knock-out 시키기 위해 targeting vector를 Osdupde1에 제작하였다. 본 과제를 시작할 때 새로운 프로락틴 유전자 하나를 클로닝하여 이 유전자를 PLP-I라고 이름을 붙였다. 이 후 이 유전자 (PLP-I)는 PLP-C${\beta}$라고 이름을 붙이게 되었다. Mouse PLP-C${\beta}$ 유전자의 counterpart를 rat에서 찾아 염기서열을 비교한 결과 mouse와 rat에서 PLP-C${\beta}$유전자의 homology는 약 79% (amino acid level)였다. 본 연구과정을 통해 또 하나의 새로운 PLP-C subfamily member를 mouse로부터 클로닝 하였고, 이 유전자를 PLP-C${\gamma}$라 하였다. PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$의 발현 유형은 Northern blot과 in 냐셔 hybridization 분석에 의해 태반의 제한된 spongitrophoblast와 trophoblast giant cells에서만 발현하는 것을 밝혔다. 놀랍게도 이들 두 새로운 유전자는 alternative splicing에 의해 두 종류의 isoform이 있음을 밝혔다. PLP family member 유전자로서 splicing에 의한 isoforms을 보여 주는 유전자로는 PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$가 최초이다. 이들 isoform mRNAs의 발현 유형은 RT-PCR 방법을 이용하여 규명하였다. 또 하나의 새로운 발견은 PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$가 독특한 유전자 구조를 갖고 있었다. 즉, PLP-C${\beta}$는 exon3의 alternative splicing에 의해 5개 혹은 6개의 exons을 갖는 two isoforms이 생긴다. 반면에 PLP-C${\gamma}$는 exon2가 alternative splcing이 되면서 7개의 exons을 갖거나 6개의 exons을 갖는 isoforms을 만든다. 그리고, PLP-C${\gamma}$의 promoter activity를 trophoblast Rcho-l${\gamma}$ 세포주를 이용하여 PLP-C${\gamma}$ 의 1.5 kb 5'-flanking 지역이 trophoblast-specific promoter activity를 갖고 있음을 밝혔다. PLP-C${\gamma}$ 유전자의 transcription start site는 Primer extension에 의해 밝혔다. 제 1차 년도의 연구결과를 토대로, 2차년에서는 다음단계의 연구를 수행하고자 한다. 즉, 1) mPsx2와 rPsx3의 promoter를 비교분석 함으로서 mouse와 rat에서 Psx 유전자가 다르게 조절되는 메카니즘 규명, 2) Psx와 PLP-C 유전자의 promoter에 있는 cis-acting elements 탐색, 3) Psx2와 Psx3의 단백질을 이용하여 이들이 binding하는 target sequence 규명, 4) 제작한 Psx2 targeting vector를 이용하여 ES cells에서 Psx2 유전자 knock-out, 5) Psx 유전자를 과발현시키는 세포주를 만들고 Psx에 의해 조절되는 유전자 탐색, 6) 새로 밝히 PLP-C members 유전자들의 조절기전을 Rcho-1 세포주를 이용하여 여러 거지 성장인자와 다른 호르몬에 대한 반응을 탐색, 7) Psx와 PLP-C${\gamma}$ 유전자의 chromosomal mapping 등을 밝힐 것이다.

• The Plant Pathology Journal
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• 제22권3호
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• pp.265-270
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• 2006

Cultivated hot pepper crops showing severe mosaic symptom were found in Korea in 2004 and their causal agent was identified as Cucumber mosaic virus (CMV). These pepper crops was resistant to the virus in the filled, and they belonged to pathotype 0 (P0) resistant pepper. Resistance screening of selected pepper plants showed that a pepper isolate of CMV was the P0 resistance-breaking virus. This P0 resistance-breaking isolate of CMV, named as Ca-P1, was isolated from leaves of the virus-infected Capsicum annuum cv. Manidda that showed systemic severe mosaic symptom. Ca-P1-CMV could induce systemic mosaic symptoms on P0-susceptible (P0-S) and P0-resistant (P0-R) cultivars whereas an ordinary strain (Fny-CMV) could not infect P0-R. This result suggests that Ca-P1-CMV can overcome P0 resistant pepper cultivars. To analyze its genome sequence, the complete nucleotide sequence of RNA3 of Ca-P1-CMV was determined from the infectious full-length cDNA clone of the virus. RNA3 of Ca-P1-CMV consisted of 2,219 nucleotides. Overall sequence homology of RNA3-encoded two viral proteins (movement protein and coat protein) revealed high similarity (75.2-97.2%) with the known CMV strains. By sequence analysis with known representative strains of CMV, Ca-P1-CMV belongs to a typical member of CMV subgroup IB. The resistance and resistance-breaking mechanisms of pepper and counterpart CMV, respectively, remain to be investigated, which will enrich the genetic resources and accelerate CMV-resistant pepper breeding programs.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제23권3호
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• pp.292-301
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• 2010

Follicle-stimulating hormone (FSH) is a pituitary glycoprotein hormone that is encoded by separate alpha- and betasubunit genes. It plays a key role in stimulating and regulating ovarian follicular development and egg production in chicken. FSH signal transduction is mediated by the FSH receptor (FSHR) that exclusively interacts with the beta-subunit of FSH, but characterization of prokaryotic expression of the FSHb gene and its effect on the expression of the FSHR gene in local chickens have received very little attention. In the current study, the cDNA fragment of the FSHb gene from Dagu chicken was amplified using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), and inserted into the pET-28a (+) vector to construct the pET-28a-FSHb plasmid. After expression of the plasmid in E. coli BL21 (DE3) under inducing conditions, the recombination protein, $FSH{\beta}$ subunit, was purified and injected into the experimental hens and the effect on the mRNA expression levels of the FSHR gene was investigated. Sequence comparison showed that the coding region of the FSHb gene in the local chicken shared 99%-100% homology to published nucleotides in chickens; only one synonymous nucleotide substitution was detected in the region. The encoded amino acids were completely identical with the reported sequence, which confirmed that the sequences of the chicken FSHb gene and the peptides of the $FSH{\beta}$ subunit are highly conserved. This may be due to the critical role of the normal function of the FSHb gene in hormonal specificity and regulation of reproduction. The results of gene expression revealed that a recombinant protein with a molecular weight of about 19 kDa was efficiently expressed and it was identified by Western blotting analysis. After administration of the purified $FSH{\beta}$ protein, significantly higher expression levels were demonstrated in uterus, ovary and oviduct samples (p<0.05). These observations suggested that the expressed $FSH{\beta}$ protein possesses biological activity, and has a potential role in regulation of reproductive physiology in chickens.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제31권5호
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• pp.650-657
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• 2018

Objective: The study investigated the biological functions and mechanisms for controlling cashmere growth of Liaoning cashmere goat by ovarian carcinoma immunoreactive antigen-like protein 2 (OCIAD2) and decorin (DCN) genes. Methods: cDNA library of Liaoning cashmere goat was constructed in early stages. OCIAD2 and DCN genes related to cashmere growth were identified by homology analysis comparison. The expression location of OCIAD2 and DCN genes in primary and secondary hair follicles (SF) was performed using in situ hybridization. The expression of OCIAD2 and DCN genes in primary and SF was performed using real-time polymerase chain reaction (PCR). Results: In situ hybridization revealed that OCIAD2 and DCN were expressed in the inner root sheath of Liaoning cashmere goat hair follicles. Real-time quantitative PCR showed that these genes were highly expressed in SF during anagen, while these genes were highly expressed in primary hair follicle in catagen phase. Melatonin (MT) inhibited the expression of OCIAD2 and promoted the expression of DCN. Insulin-like growth factors-1 (IGF-1) inhibited the expression of OCIAD2 and DCN, while fibroblast growth factors 5 (FGF5) promoted the expression of these genes. MT and IGF-1 promoted OCIAD2 synergistically, while MT and FGF5 inhibited the genes simultaneously. MT+IGF-1/MT+FGF5 inhibited DCN gene. RNAi technology showed that OCIAD2 expression was promoted, while that of DCN was inhibited. Conclusion: Activation of bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway up-regulated OCIAD2 expression and stimulated SF to control cell proliferation. DCN gene affected hair follicle morphogenesis and periodic changes by promoting transforming growth $factor-{\beta}$ ($TGF-{\beta}$) and BMP signaling pathways. OCIAD2 and DCN genes have opposite effects on $TGF-{\beta}$ signaling pathway and inhibit each other to affect the hair growth.

• IMMUNE NETWORK
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• 제1권1호
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• pp.77-86
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• 2001

Background: Hepatitis C virus(HCV), a family of Flaviviridae, has a host cell-derived envelope containing a positive-stranded RNA genome, and has been known as the maj or etiological agent for chronic hepatitis, hepatic cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. There remains a need to dissect a molecular mechanism of pathogenesis for the development of therapeutic and effective preventive measure for HCV. Identification of cellular receptor is of central importance not only to understand the viral pathogenesis, but also to exploit strategies for prevention of HCV. This study was aimed at identifying peptide mimotopes inhibiting the binding of E2 protein of HCV to MOLT-4 cell. Methods: In this study, phage peptide library displaying a random peptides consisting of 7 or 12 random peptides was employed in order to pan against E2 protein. Free HCV particles were separated from the immune complex forms by immunoprecipitation using anti-human IgG antibody, and used for HCV-capture ELISA. To identify the peptides inhibiting E2-binding to MOLT-4 cells, E2 protein was subj ect to bind to MOLT-4 cells under the competition with phage peptides. Results: Several phage peptides were selected for their specific binding to E2 protein, which showed the conserved sequence of SHFWRAP from 3 different peptide sequences. They were also able to recognize the HCV particles in the sera of HCV patients captured by monoclonal antibody against E2 protein. Two of them, showing peptide sequence of HLGPWMSHWFQR and WAPPLERSSLFY respectively, were revealed to inhibit the binding of E2 protein to MOLT-4 cell efficiently in dose dependent mode. However, few membrane-associated receptor candidates were seen using Fasta3 programe for homology search with these peptides. Conclusion: Phage peptides containing HLGPWMSHWFQR and WAPPLERSSLFY respectively, showed the inhibition of E2-binding to MOLT-4 cells. However, they did not reveal any homologues to cellular receptors from GenBank database. In further study, cellular receptor could be identified through the screening of cDNA library from MOLT-4 or hepatocytes using antibodies against these peptide mimotopes.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제30권8호
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• pp.1175-1182
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• 2017

Objective: To create genetically modified goat as a biopharming source of recombinant human lacotoferrin (hLF) with transcription activator-like effector nucleases. Methods: TALENs and targeting vector were transferred into cultured fibroblasts to insert hLF cDNA in the goat beta-lactoglobulin (BLG) locus with homology-directed repair. The gene targeted efficiency was checked using sequencing and TE7I assay. The bi-allelic gene targeted colonies were isolated and confirmed with polymerase chain reaction, and used as donor cells for somatic cell nuclear transfer (SCNT). Results: The targeted efficiency for BLG gene was approximately 10%. Among 12 Bi-allelic gene targeted colonies, five were used in first round SCNT and 4 recipients (23%) were confirmed pregnant at 30 d. In second round SCNT, 7 (53%), 4 (31%), and 3 (23%) recipients were confirmed to be pregnant by ultrasound on 30 d, 60 d, and 90 d. Conclusion: This finding signifies the combined use of TALENs and SCNT can generate biallelic knock-in fibroblasts that can be cloned in a fetus. Therefore, it might lay the foundation for transgenic hLF goat generation and possible use of their mammary gland as a bioreactor for large-scale production of recombinant hLF.

• 유기물자원화
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• 제23권1호
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• pp.70-81
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• 2015

Helicase는 NTP 결합의 화학적 에너지를 이용하여 이중가닥의 DNA와 RNA를 단일가닥으로 분해하여 다양한 생체반응에 기여하는 단백질로 알려져 있으며, 이 중 DEAD-box의 단백질은 주로 RNA와 관련된 대부분의 생화학적 반응에 작용하는 ATP 의존성 helicase로 알려져 있다. 또한 이 단백질 부류에 속하는 DEAD-box3 (DDX3) gene은 척추동물뿐만 아니라 무척추동물에서의 유성 생식과 무성 생식에서 생식세포 발달 및 재생과정 중 줄기세포 분화에 중요한 역할을 하는 인자로 알려져 있다. 이에 본 연구는 강한 재생능력을 가진 것으로 알려져 있는 팔딱이 지렁이(Perionyx excavatus)에서 DDX3 gene을 동정하고 그 발현양상을 알아보고자 환대를 포함하는 성체 지렁이의 두부를 절단하여 total RNA를 추출하고, 이를 주형으로 RT-PCR을 수행하여 full length의 DDX3 gene인 Pe-DDX3를 검출하였다. Pe-DDX3는 607개 아미노산 서열로 이루어져 있으며, DEAD-box 단백질 그룹 내에서 특이적으로 보존되어 있는 9개의 motif가 존재하고 있다. 다른 분류군에 속하는 동물들과의 multiple alignment를 통해 서열 내에 보존되어 있는 아미노산 서열을 확인할 수 있었으며, 아미노산 차원에서의 계통수 분석을 통해 DDX3 (PL10) 하부그룹에 속하는 것을 알 수 있었으며, 또한, 같은 그룹에 속하는 동물 중 P. dumerilii의 PL10a, b 단백질과 가장 가까운 유연관계를 확인 할 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제16권2호
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• pp.274-281
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• 2006

흑두청국으로부터 분리된 혈전용해력이 우수한 Bacillus subtilis BB-1(KFCC 11344P)으로부터 혈전용해효소 유전자를 PCR법에 의해 크로닝하였고 이를 BCF-1으로 명명하였다. BCF-1의 DNA 염기서열결정 결과 1,145 bp 크기의 혈전용해 효소로, 일본의 natto로부터 분리된 nattokinase 유전자와 99%의 상동성을 보임을 확인하였다. 혈전용해효소 유전자의 발현을 위하여 Bacillus 발현계인 Bacillus-E. coli의 shuttle vector인 pEB vector에 크로닝 하고 host로서 B. subtilis 168에 형질전환시켜 대량 발현시켰다. 생산된 혈전용해효소의 최 적활성 pH와 온도는 7.0과 $35^{\circ}C$로 확인되었다, 기질에 대한 분해양상을 조사한 결과 fibrin에서만 특이적으로 강한 분해가 일어났으며, skim milk에서 아주 약한 분해능을 보였으나 blood agar, gelatin, casein에서는 전혀 분해능을 보이지 않았다. 특히 blood agar plate에서 분해능이 없는 것으로 보아 혈액 내에서의 적혈구 파괴현상과 같은 부작용에 대한 위험을 배제할 수 있을 것으로 사료된다. BCF-1에 의해 생산된 혈전용해효소는 fibrin 특이적으로 활성을 나타냄을 확인할 수 있으며, 이는 임상적이나 산업적으로 적용하였을 때 부작용에 대한 위험적인 문제는 배제될 수 있으리라 생각된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제4권1호
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• pp.101-108
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• 2000

자궁내막증은 흔한 부인과적 질병이며 여성 불임의 한 원인이 되나 그 발생 원인에 대하여서는 아직 논란의 여지가 많다. 최근 월경혈의 역류에 의하여 자궁내막증이 생긴다는 가설이 가장 유력한데 자궁내막증 환자가 정상여성에서보다 역류되는 월경혈의 양이 많거나 침습성이 강한 것이 자궁내막증의 발생원인이 될 수 있다는 이론들이 소개되었다. Pleitrophin (PTN)이나 midkine(MK)은 성장 및 분화에 관여하는 인자로서 여러 종류의 악성 종양에서 그 발현이 보고되어있으며 종양화 (carcinogenensis), 맥관형성 (angiogenesis), plasminogen activator의 활성화 증가 등에 관여한다고 보고된 바 있다. 이에 자궁내막증 환자의 자궁 내막과 대조군의 자궁내막에서 PTN과 MK mRNA의 발현의 차이를 quantitative competitive RT PCR로 비교하였다. 그 결과 자궁내막증 환자의 황체기 자궁내막에서 대조군의 자궁내막에 비하여 PTN과 MK의 발현이 높게 나타났다. 이러한 PTN과 MK의 발현의 증가로 자궁내막증 환자의 자궁내막이 복강 내에서 더욱 쉽게 맥관형성을 하고 성장이 촉진되어 자궁내막증이 발생될 것으로 생각되어 PTN과 MK가 자궁내막증의 초기 발생과정에 관여할 가능성이 있다.

• Journal of the Korean Wood Science and Technology
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• 제34권3호
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• pp.56-63
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• 2006

셀룰로오스의 가수분해 기작을 구명하기 위하여 Phanerochaete chrysosporium으로부터 74A (PcGHF74A) 유전자를 클로닝한 결과 2162 bp의 염기서열에 해당하는 721개의 아미노산을 가지고 있으며, 다른 사상균에서 유래한 GHF74와 70~77%의 상동성을 나타냈다. Phanerochaete chrysosporium GHF74B (PcGHF74B)는 family 1에 속하는 Cellulose Binding Module (CBM)을 가지고 있으며 셀룰로오스 배양계에서 다양한 전사산물이 존재하였다. PcGHF74B 전사산물에서 나타난 splice variants를 조사하기 위해서 annotation data와 sequence data로부터 primer를 설계하여 RT-PCR분석을 수행하였으며 그 결과 다양한 배양조건에서 splice variants가 존재함을 확인하였다. 첫 번째는 annotation data와 다르게 11번째 intron을 포함하고 있어 full length로 추정되어지는 것으로 2562 bp에 stop codon이 존재했으며, 두 번째는 7번째 exon 1187 bp에 stop codon을 가지고 있으며 12개의 exon으로 구성되어 있다. 세 번째는 10개의 exon과 9개의 intron을 포함하고 있으며 7번째 exon에 stop codon이 존재했다. Splice variants로서 intron에 나타난 stop codon으로 인해 활성단백질의 합성이 일어나지 않을 것이며 비활성 단백질을 생성하거나 원래의 GHF74의 기능이 아닌 다른 새로운 기능을 갖는 단백질을 생성할 수 있을 것으로 사료된다.