한국생물정보시스템생물학회 2006년도 Principles and Practice of Microarray for Biomedical Researchers
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pp.11-18
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2006
바이오칩의 대표 주자인 DNA 칩은 점차 분자생물학의 주요 도구로 인식되고 있다. 쓰임새 또한 다양해져 기초 생물학, 기능 유전체학 연구뿐만 아니라 임상 현장에서의 적용을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 임상분야에서 최근 주목 받고 있는 분야가 DNA 칩을. 이용한 질병진단 및 예후 측정이다. 개별 환자 세포의 분자유전학적 상태는 DNA 칩의 유전체 프로파일링(genome-wide profiling)으로 상세히 파악될 수 있으므로, DNA 칩은 질병의 세부아형 진단, 약물에 대한 개인 민감도 측정, 정확한 예후 측정을 통한 환자의 세심한 관리 등 미래 의료의 핵심이라 할 수 있는 개인별 맞춤 치료(personalized medicare)를 가능하게 하는데 지대한 역할을 할 것으로 기대되고 있다. 특히 수많은 질병 중에서 현대인의 난치병으로 손꼽히는 암은 DNA 칩 분석의 주요 적용 대상이다. 암에 연관된 복잡한 메커니즘을 기존의 단일 표지자로 진단하는 데는 한계가 있기 때문에, DNA 칩을 이용해 질병의 특정 phenotype과 관련 있는 암의 특이 패턴을 전사체 수준에서 분석하여 새로운 형태의 분자유전학적 표지자(transcriptional molecular signature)를 발굴하는 것이다 본 발표에서는 이러한 연구에 쓰이는 DNA 칩 분석 방법들과 실제 위암 데이터에 적용한 사례에 대해 논의하고자 한다. 연세의대 암전이 연구센터의 17K cDNA 칩을 이용하였으며, 진단 및 예후 측정을 위한 여러 분석 방법을 수행하였다.
세계는 지금 post-genome 시대에 접어들고 있고, 하루에도 수백개 이상 밝혀지는 새로운 유전정보들이나 모든 유전암호가 밝혀진 생물들을 기존의 방법들로 연구한다는 것은 너무나 많은 시간을 요구한다. 즉, 인간 게놈 프로젝트 뿐만 아니라, 식물 게놈 프로젝트 등 다양한 분야에서 DNA chip의 필요성이 인식되고 있다. 그러나 우리나라는 DNA chip의 생산에 있어서 chip 제작에 필수적인 DNA chip 제작용 microarrayer를 고가를 들여 수입에 의존하고 있는 실정이다. 이는 DNA chip 생산비를 높이고, 더 나아가 우리나라 생명공학분야 연구의 발전에 악영향을 미치는 결과를 초래할 수 있다. 몇몇 국내 생산 업체가 있지만, 아직 그 실요성을 입증하지 못하였고, 대부분의 chip 공급업체는 아직 수입품을 사용하고 있는 상태이다. 이에 본 연구에서는 microarrayer의 국산화를 통해 안정적 DNA chip 및 microarrayer의 공급을 위해 microarrayer의 개발에 관해 수행하는 연구이며, 앞으로의 연구방향을 다음과 같이 설정하였다. 1) 유전자 검색을 위한 DNA chip 제작용 로봇 시스템 (microarrayer)을 pin 타입으로 설정한다. 2) 정밀도 향상을 위하여 로봇 시스템의 구동은 XYZ 직교좌표형으로 설정한다. 3) 1$cm^2$당 5,000개 정도의 DNA를 붙일 수 있도록 한다.
DNA 데이터 저장(Data storage)은 DNA의 염기 서열에 대용량의 디지털 데이터를 저장하는 방법으로, 차세대 정보 저장 매개물로 인식되고 있다. 본 논문에서는 DNA 스테가노그라픽 기반으로 비부호 DNA 서열(Noncoding DNA sequence)에 정보를 저장하는 방법을 제안한다. 제안한 방법은 암호화된 데이터들을 정수 변화표에 의하여 데이터 염기 서열로 변환한 후, 시드 정보, 및 섹터 길이로 구성된 은닉 키에 의하여 비부호 염기 서열에 은닉한다. 따라서 단백질의 유전 기능이 유지되고, 원 DNA 서열없이 정보가 검출되며, 변이에 의하여 발생되는 오류가 검출된다. 기존 방법과의 비교 실험을 통하여 제안한 방법이 높은 bpn를 가지는 저장 효율을 가지며, 패리티 염기에 의하여 은닉된 정보의 오류 위치를 검출할 수 있음을 확인하였다.
DNA의 제한요소단편 다형현상(RFLP)이 유전변이 연구에 널리 이용되고 있다. 본 연구는 파밤나방(Spodoptera exigua(H bner)) 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 RFLP방법을 개발하기 위해 게놈 크기 측정 및 PCR primer들을 선발하였다. 파밤나방의 mtDNA 전체크기는 약 16kb였다. 대부분 곤충 mtDNA에 적합하게 구성된 (Simon et al., 1994)29개 promer들중 21개가 파밤나방의 mtDNA증폭에 적합했다. 이들 primer들을 이용하여 여러 유전자 영역(CO-I, CO-II, Cyt-B, ND-1, 12S rRNA, 16S rRNA 및 일부 tRNA)의 일분 또는 전체를 포함하는 유전자 절편을 증폭시켰다. 일반적으로 다형을 보이는 primer조합을 중심으로 4염기 제한부위를 인식하는 8종의 제한 효소를 통해 분석된 PCR-RFLP는 서로 다은 지역(안동, 경산, 순천) 집단들간에 제한부위에 있어서 차이가 없었으나 일부 영역에서는 길이 차이를 보여 유용한 유전지표로서의 가능성을 제시했다.
미국과 캐나다는 한국에 분포하는 잎응애속(Tetranychus)중 범세계적 분포종인 점박이응애(T. urticae Koch)를 제외한 벚나무응애(Tetranychus vienensis Zacher), 차응애(T. kanzawai Kishida), 뽕나무응애(T. truncatus Ehara)를 검역대항으로 하고 있다. 잎응애속 응애들은 암컷성충으로 월동휴면에 들어가는데 기존의 수컷생색기의 형태를 위주로 한 동정방법으로는 이 휴면태의 암컷을 정확히 동정하기 어렵다. 월동을 위해 사과 과실 꼭지부에 우발적으로 부착할 가능성이 있는 것으로 우려되는 잎응애속 응애들의 월동휴면태에 대한 신속, 정확한 동정법이 수출검역현장에서 절실히 요구되는 실정이다. 사과의 주요해충인 점박이응애와 과수원 주변에서 발견되는 벚나무응애, 뽕나무응애, 차응애의 미토콘드리아 DNA(mtDNA)내 cytochrome oxidase subunit I(CO-I) 유전자를 PCR로 증폭하고 증폭된 DNA의 종간 변이를 이용하여 발육영기나 암수에 관계없이 동정할 수 있는 방법을 찾는 연구를 수행하였다. 세쌍의 primer에 의해 미토콘드리아 DNA의 CO-I 유전자 일부(680 bp)를 중복되게 증폭하였고 증폭된 유전자는 제한효소 AluI, DdeI, Sau3A 대하여 응애종간 특이적 인식부위를 가지고 있었다. 제한효소에 의해 절단되는 특이적 DNA 단편은 Tetranychus 응애류를 동정하는데 유용한 표식인자로 사용될 수 있을 것이다. 아울러 증폭한 CO-I 유전자내의 제한효소 인식부위에 대한 이들 4종 응애의 유전자지도를 작성하였다.
CRISPR/Cas를 이용한 유전체 편집과 유전자 발현 조절을 위한 기술에서 sgRNA는 표적서열을 인식하는 역할을 한다. gal 프로모터를 표적서열로 하여 유전체 편집에 필요한 sgRNA의 표적인식서열의 길이와 유전자 발현 조절에 필요한 sgRNA의 표적인식서열의 길이를 Cas9-NG에서 체계적으로 비교하였다. 유전체 편집의 경우, sgRNA의 표적인식서열을 구성하는 20개의 뉴클레오티드에서 3개의 뉴클레오티드의 결손만을 허용하였다. 하지만, 유전자 발현 조절에는 표적인식서열에서 11개의 뉴클레오티드가 결손되어도 표적서열을 인식하고 결합할 수 있다는 것을 밝혔다. 따라서, sgRNA의 표적인식서열에서 4개 이상의 뉴클레오티드의 결손이 있는 경우에 sgRNA/Cas9-NG는 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합을 하지만, 엔도뉴클레아제의 활성을 갖지 못하기 때문에 유전체 편집을 할 수 없는 것으로 판단된다. 이 결과는 인공전사인자 개발과 합성생물학 분야의 다양한 CRISPR 기술 발전에 도움을 줄 것이다.
한국 두 지역의 참굴(CRassostrea gigas Thunberg) 과 일본산 참굴, 그리고 한국산 바위굴(Crassostrea nippona Seki)의 유전적 근연관계를 조사하기 위하여 미토콘드리아 DNA 절편분석을 하였다. 참굴의 전체 미토콘드리아 DNA 크기는 세 지역 모두 약 18 kb 로서 동일하였으나 한국 동해산 바위굴의 경우는 약 22 kb 정도의 크기를 나타내었다. 여섯 개 염기쌍을 인식하는 8종류의 제한효소를 사용하여 분석한 결과 세 지역 참굴의 mtDNA에서 BamHI과 Bg1I 그리고 XhoI 절단시 동일한 DNA 절편이 나타나는 특징이 있었다. 종내 지역간 염기서열 치환율 (p) 은 남해안과 서해안산 참굴에서 2%로 가장 가까운 근연관계를 보였으며, 이들과 일본산 참굴 사이에는 5%의 p값을 보였다. 참굴과 바위굴, 두 종간에서는 약 42% 의 염기서열 치환율을 갖는 근연관계를 나타내었다.
본 연구에서는 DNA 바코드, 즉 엽록체 DNA의 rbcL, matK와 핵 리보솜 DNA의 ITS 염기서열을 이용하여 한국산 도둑놈의갈고리족 식물들의 종 식별을 실시하였다. 총 5개속 25분류군(총 75개체)의 식물에 대한 염기서열이 밝혀졌고, DNA 바코드 구간 조합에 따라 neighbor-joining 계통수들이 작성되었다. 그 결과, 종 식별률은 DNA 바코드 3개의 구간을 모두 사용하였을 때 가장 높게 나타났다(72%). rbcL+matK+ITS 계통수에서 본 족의 두 개의 아족과 다섯 속들은 단계통군으로 유집되었다. 도둑놈의갈고리아족군에서 도둑놈의 갈고리속과 갈고리속이 된장풀속보다 더 가깝게 묶였다. 갈고리속군에서 큰도둑놈의갈고리는 개도둑놈의갈고리 복합체의 자매군으로 형성되었고, 개도둑놈의갈고리의 종내분류군들은 각각 단계통을 형성하였다. 특히 형태적 변이로 인해 도둑놈의갈고리의 변종 또는 개도둑놈의갈고리와의 중간형으로 인식된 바 있는 긴도둑놈의갈고리는 개도둑놈의갈고리와 가장 가깝게 묶였다. 한편 도둑놈의갈고리의 변종이나 이명으로 인식되어온 애기도둑놈의갈고리는 변종으로 판단되었다. 싸리아족군의 경우, 매듭풀속 분류군들은 계통수상에서 각각 단계통으로 지지되었으나, 싸리속의 식물 16분류군 중 9분류군만 종식별이 가능하였다. 특히 싸리속내 땅비수리절보다 싸리절에서 낮은 종판별 해상능이 나타났다(싸리절=28.5%, 비수리절=77.8%). 싸리속 식물 중에 비수리는 계통수상에서 형태적으로 유사한 자주비수리와 확연히 구분되었다. 잡종으로도 인식된 바 있는 해변싸리와 청비수리 중, 해변싸리는 독립종으로 판단되었다. 반면 청비수리는 잡종 여부를 판단할 수는 없었지만, 땅비수리와 근연 관계에 있는 것으로 사료된다.
유전자 감식법은 1980년대 후반에 미국에서 처음으로 법의학적으로 적용된 이래, 강력범죄, 친자확인 및 항공기 추락사고, 화재 등의 대형 참사의 신원 확인에 큰 공헌을 하였다. 유전자감식을 위해서는 높은 다형성을 보이는 STR (short tandem repeats) 좌위의 타이핑을 주로 이용한다. 한편, 최근 줄기세포 (stem cell)의 중요성이 인식되면서 폐기되던 제대혈의 보관 사업이 활성화되고 있다. 본 연구에서는 제대혈의 보관시 STR 타이핑의 유전 정보를 표기한 유전자 캐릭터를 동시에 제공하여 불의의 사고시 신원확인이 가능하게 하고, 아울러 이산가족에 대한 DNA정보 데이터베이스 구축 및 검색 프로그램을 개발하였다.
The genetic variation in mitochondrial DNA (mtDNA) was analysed within and between two species of tree frogs. Hyla japonica and H. suweonensis from South Korea. Purified mtDNAs were digested with each of 11 restriction enLvmes which cleave at six base recognition sequences. The genome size of H. iaponica revealed ho types (20.0 $\pm$ 0.3 and 19.6 $\pm$ 0.3 kb) and this difference is explained by either addition or deletion of about 0.4 kb fragment. On the other hand, the genome sire of H. suueonensis was about 19.0 $\pm$ 0.4 kb only. For the analysis, level of fragment homology (F) and nucleotide sequence divergence (p) were estimated from comparisons of digestion profiles. Among four populations of H. iaponica, substantial mean sequence divergence was 0.017 (range 0.001-0.026); between identical types, 0.001 IslilaRl type) and 0.004 (Large type) respectively; between different ones, 0.024 (range 0.023-0.026). The level of sequence divergence between he species was 0.142 (range 0.131-0.146). This result suggested that he species ㅂwere distinctly differentiated species. The divergence time between ko species was estimated 7.1 million years.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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