Rat brain succinic semialdehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.24 SSADH) activity was detected in mitochondrial, cytosolic and microsomal fractions. Brain mitochondrial soluble SSADH was purified by ammonium sulfate precipitation, DEAE Sephacel, and 5'-AMP Sepharose 4B affinity chromatography. The purified enzyme was shown to consist of four identical subunits, and the molecular weight of a subunit was 55 kD. The $K_m$ for short chain aliphatic aldehydes and aromatic aldehydes were at the $10^{-3}M$ level but that for succinic semialdehyde was 2.2 ${\mu}M$. Either $NAD^+$ or $NADP^+$ can be used as a cofactor but the affinity for $NAD^+$ was 10 times higher than that for $NADP^+$. The brain cytosolic SSADH was also purified by ammonium sulfate precipitation, DEAE Sephacel, Blue Sepharose CL-6B and 5'-AMP Sepharose 4B affinity chromatography and its Km for short chain aliphatic aldehydes was at the $10^{-3}$ level but that for succinic semialdehyde was 3.3 ${\mu}M$. $NAD^+$ can be used as a cofactor for this enzyme. We suppose that both enzyme might participate in the oxidation of succinic semialdehyde, which is produced during GABA metabolism. The activity of both cytosolic and mitochondrial SSADH was markedly inhibited when the concentration of succinic semialdehyde was high. The reciprocal plot pattern of product inhibition and initial velocity indicated a sequential ordered mechanism for mitochondrial matrix SSADH. Chemical modification data suggested that amino acid residues such as cysteine, serine and lysine might participate in the SSADH reaction.
Aspergillus niger SFN-416으로 부터 생성한 xylanase I를 분리.정제하여 특성을 조사하였다. Aspergillus niger SFN-416의 배양액을 ethanol(70%) 침전, $(NH_4)_2-SO_4$(30~90%) 침전, Sephadex G-100 chromatography 및 DEAE-Sephacel ion chromatography 등의 정제과정을 거친 결과, 10.2배 정제되었고, 정제효소의 최적 활성온도는 $50^{\circ}C$ 였다.최적 pH는 3.5이었고, pH 안정성은 6.0 이상에서 활성이 급격히 감소하였다. 또한 금속이온에 대한 효소의 활성은 대부분 억제를 보였고, 특히 $Hg^{2+}$는 18.5%로 가장 낮은 상대활성을 보였지만, $Fe^{2+}$는 117.0%, $Mn^{2+}$는 129.9%로 오히려 효소활성이 증가되었다. 정제 효소의 분자량은 SDS-PAGE에 의하여 31,000 daltons이 었으며, 유기용매에 대한 활성과 안정성은 10%의 methanol, ethanol, isopropanol 및 1-butanol 대하여 모두 낮은 활성을 나타내어 유기용매에는 안정하지 않는 것으로 생각된다.
본 연구에서는 Cheddar 치즈의 숙성기간을 단축시키고 flavor를 증진시키기 위하여 Micrococcus sp. LL3를 치즈 제조시에 첨가할 목적으로 본 균주가 생성하는 aminopeptidase의 특성을 조사하였으며, 또한 본 효소를 정제하였다. L-Leucine-p-nitroanilide를 기질로 사용 하였을 때 본 효소의 최적온도와 pH는 각각 $30^{\circ}C$ 및 7.0이었다. 본 효소는 $50^{\circ}C$까지의 온도에서 10분간 방치하였을 경우에도 안정하였다. $Mg^{++}$ ion에 의해 본 효소의 활성이 촉진되었으나 $Hg^{++}$ ion과 EDTA나 1,10-phenanthroline에 의해서 효소활성이 거의 실활되어 metallopeptidase인 것으로 추정되었다. 본 효소의 기실 특이성은 광범위 하였으나, N-terminal amino acid로서 arginine을 함유한 peptide는 분해하지 못했다. 본 균주가 생성하는 aminopeptidase의 정제를 위하여 DEAE-Sephacel ion chromatography및 gel filtration을 실시하였으며, 이때 분자량 46,500의 효소를 얻을 수 있었다.
저온처리($4^{\circ}C$)하에서 보리(Hordeum vulgare L. cv. Chalssal) 유식물 잎의 당함량과 sucrosephosphate synthase, sucrose synthease, invertase의 활성의 변화를 측정하고, 또한 acid invertase의 성질을 조사하였다. 저온처리 3일만에 보리유식물의 환원당과 설탕의 함량은 1.3배 및 2.4배로 각각 증가하였다. 그리고 sucrosephosphate synthase, sucrose synthase 및 alkaline invertase의 활성에는 별다른 변화가 없었으나 acid invertase의 활성은 크게 저하하였다. Ammonium sulfate 분획과 DEAE-Sephacel 컬럼으로 부분정제한 acid invertase에서, 설탕에 대한 Km은 9.5mM이고 최적 pH는 5.5, 최적온도는 $35^{\circ}C$로 측정되었다. 여러 가지 기질에 대한 특이성을 조사한 결과 본 효소는 ${\beta}-fructosidase로$ 추정할 수 있었으며, 효소의 분자량은 Sephadex G-200 컬럼 크로마토그래피로 산출하였을 때 63 Kd이었다.
본 연구에서는 식물의 제초제 해독 기구를 알아보기 위해, 양배추 (Brassica oleracea)로 부터 글루타티온 전달효소를 정제하고 외래성 이물질에 대한 기질 특이성과 저해 효과를 분석하였다. 양배추로부터 DEAE-Sephacel 컬럼과 GSH-Sepharose 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 약 10%의 수율로 글루타티온 전달효소를 정제하였다. 정제된 효소에 대해 분자량을 측정한 결과, SDS-polyacrylamide 겔 전기영동으로 측정한 분자량은 23,000Da을 나타내었으며, 겔 크로마토그래피로 측정한 분자량은 48,000Da을 나타내었다. 따라서 정제된 양배추 글루타티온 전달효소는 소단위체의 분자량이 약 23,000Da의 동종이량체라는 사실을 알 수 있었다. 이 효소의 저해제에 대한 효과를 조사한 결과, S-hexyl-GSH와 S-(2,4-dinitrophenyl)GSH에 의해 활성이 저해되었다. 양배추 글루타티온 전달효소의 기질특이성은 CDNB와 ETA에서 높은 활성을 보였으며, cumene hydroperoxide에 대한 GSH peroxidase 활성도 나타내었다.
Serratia marcescens ATCC 25419를 질소원이 풍부한 BHI 배지에서 황산 암모늄 분별 침전을 시킨 후 DAEA-Sephacel chromatography, Phenyl-Sepharose hydrophobic chromatography, Sephacryl S-400 gel filtration, native gel elution을 거쳐 ALS isozyme Rf 0.83을 분리하였다. 분리한 ALS isozyme Rf 0.83의 native 형태는 gel filtration을 이용하여 분자량을 측정한 결과, 531,400이었고, SDS-PAGE를 수행한 결과 55,000의 large subunit와 38,900의 small subunit로 구성된 multimer임을 알 수 있었다.
Park, Pyo-Jam;Lee, Sang-Hoon;Byun, Hee-Guk;Kim, Soo-Hyun;Kim, Se-Kwon
BMB Reports
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제35권6호
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pp.576-582
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2002
Collagenase from the internal organs of a mackerel was purified using acetone precipitation, ion-exchange chromatography on a DEAE-Sephadex A-50, gel filtration chromatography on a Sephadex G-100, ion-exchange chromatography on DEAE-Sephacel, and gel filtration chromatography on a Sephadex G-75 column. The molecular mass of the purified enzyme was estimated to be 14.8 kDa by gel filtration and SDS-PAGE. The purification and yield were 39.5-fold and 0.1% when compared to those in the starting-crude extract. The optimum pH and temperature for the enzyme activity were around pH 7.5 and $55^{\circ}C$, respectively. The $K_m$ and $V_{max}$ of the enzyme for collagen Type I were approximately 1.1 mM and 2,343 U, respectively. The purified enzyme was strongly inhibited by $Hg^{2+}$, $Zn^{2+}$, PMSF, TLCK, and the soybean-trypsin inhibitor.
Micrococcus luteus 가 생산하는 isocitrate lyase 의 효소단백질을 ammonium sulfate precipitation, DEAE-cellulose, DEAE-sephacel, 1차 Sephadex G-200, 2 차 Sephadex G-200 column chromatography 과정을 통하여 분리 정제하였으며 정제된 효소의 분자량과 효소학적 특성을 조사하였다. 정제된 isocitrate lyase 는 상기 정제 과정을 통하여 10.2%의 회수율과 38.8 의 정제도를 나타내었으며, 전기영동시 단일밴드를 얻을 수 있었고, SDS-PAGE 에 의해 측정된 분자량을 약 60,000이며 1개의 subunit 로 나타났다. 본 효소의 최적 pH 는 7.5이었으며, 최적 온도는 $40^{\circ}C$ 부근이었고 $45^{\circ}C$까지는 안정하였다. 2가 금속염의 첨가시$ Mg^{2+}$ 를 제외한 다른 금속이온들은 효소활성을 저해하는 것으로 나타났으며 $Mg^{2+}$의 농도는 5 mM 에서 최대활성을 나타내었다. 또한 기질인 DL-isocitrate 의 $K_{m}$ 치는 0.95 mM 로 나타났으며, thiol 화합물의 첨가시 cysteine 은 1mM, glutathione과 $\beta$-mercaptoethanol 은 5 mM 의 농도에서 효소활성이 최대에 달하였다.
In order to produce the single chain precursor of a novel human insulin analogue, (B30-Homoserine) insulin, the fermentative behaviors of Escherichia coli JM103 were studied, which harbors pKBA plasmid carrying a hybrid gene in which the gene for a single chain precursor was fused with lacZ gene under tac promoter. The maximal induction of gene expression was achieved when more than 0.05 mM of isopropyl-$\beta$-D-thiogalactopyranoside(IPTG) was supplemented to fermentation medium after 4 h cultivation of E. coli, and followed by longer than 2-h fermentation. The hybrid protein of the single chain insulin precursor was isolated from cytoplasmic inclusion bodies by dissolving in 8M urea solution, and purified through DEAE-Sephacel and Sephadex G-200 column chromatographies with a recovery of 35%. The finally purified hybrid protein showed a single band on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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