한국산 유혈목이에서 스파르가눔 충체를 수집하고, 이들 충체의 추출액에서 ion-exchange chromatography와 affinity chromatography를 실시하여 cysteine proteinase를 순수 정제하였다. 경제된 효소의 최적 pH는 5.5이었고, 최적 mole 농도는 0.IM (0.1M sodium acetate, pH5.5) 이었다. 정제된 대소는 thiol-dependent이고, $4^{\circ}C$에서 pH 5.0일 때 24시간 동안 안전성을 보였다. 효소의 환성도는 저분자 합성기질인 CBZ-phe-arg-AFC에 대 해 활성이 높았다. 정제된 효소는 척추동물의 산성 cysteine proteinase의 억제인자에 감수성을 보였다. UItrogel AcA54 column chromatography로 정제된 cysteine proteinase의 분자량을 측정한 결과 28,000 dalton이었다. 정제된 효소는 collagen type I과 hemoglobin을 분해하였다. Immunoblot한 결과 정제된 효소는 스파르가눔증 환자의 혈청과 반응하였다. 이상의 결과에서 스파르가눔의 cysteine proteinase는숙주 체내이동, 조직침수성 및 영양소 섭취에 관여할 것이라 추정되며, 정제된 효소는 스파르가눔 현중의 혈청학적 진단에 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
The present study intended to verify activities of cysteine proteinase of Pneumocystis carinii from rats and to purify the enzyme. In order to exclude the contamination of host-derived enzymes, concentrates of P. carinii was primarily treated with a mixture of proteinase inhibitors before Iysis of P carinii. A 68-kDa cysteine proteinase was finally purified from the crude extract of P. carinii by 4 sequential chromatographic methods. The enzyme showed an optimal activity at pH 5.5 in 0.1 M sodium acetate, and its activity was specifically inhibited by L-trans-epoxy-succinylleucylamido (4-guanidino) butane (E-64) and iodoacetic acid, suggesting that the enzyme is a cysteine proteinase. The 68-kDa proteinase weakly digested rnacrornolecules such as collagen, hemoglobin and fibronectin. The present study demonstrated the activity of cysteine proteinase at the 68-kDa band of P. carinii, and purified and characterized the molecule.
Duk-Young MIN;Keun-Hee Hyun;Jae-Sook Ryu;Myoung-Hee AHN;Myung-Hwan CHO
Parasites, Hosts and Diseases
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제36권4호
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pp.261-268
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1998
질편모충의 시스테인 단백분해효소가 숙주-기생충 관계에서 어떤 역할을 하는지 알아보기 위해 질편모충을 대량배양하여 초음파분쇄한 후 초원심분리하여 조추출물을 얻었고, activated Thiol-Sepharose 4B, Bacitracin Sepharose affinity chromatography, Sephacryl S-200 HR gel filtration 등을 이용하여 단백분해효소를 정제하였다. SDS-PAGE로 정제도를 확인하여 이들 효소의 생화학적 특성, 그리고 인체 면역글로불린 및 헤모글로빈 분해능을 관찰하였다. 정제된 단백분해효소는 0.1 M sodium phosphate (pH 6.0)에서 최적 활성을 나타내었으며, SDS-PAGE에서 분자량은 60 kDa이었고 gel filtration에서 native 분자량은 62 kDa이었다. 정제된 단백분해효소는 시스테인 계열 억제제인 E-64, IAA, NEM에 의해서 활성이 억제되었으며, 메탈로, 세린, 아스파틱 계열 억제제에 의해서는 활성이 억제되지 않았다. $Hg^{2+}$ 이온에 의해 활성이 억제되었고 시스테인 계열 활성제인 DTT에 의해서는 2배 이상의 활성을 보여 정제된 단백분해효소가 시스테인 계열임을 알 수 있었다. 정제된 단백분해효소와 serum IgG, serum IgA, secretory IgA를 반응시켰을 때 면역글로불린이 분해되었고 헤모글로빈과 반응시켰을 때도 헤모글로빈을 분해하였다. 이상의 결과로 보아 질편모충에서 정제한 60 kDa acidic 시스테인 단백분해효소는 인체의 IgG, IgA 및 헤모글로빈 등을 분해하여 숙주의 면역기작을 회피하며 영양대사에 이용할 것으로 생각된다.
이 연구에서는 질편모충의 단백질 분해효소를 부분정제하고 그 특성을 관찰하였다. 질염환 자에서 얻은 질편모충 분리주 KT-9을 sonicator로 분쇄 원심분리하여 상청액을 얻어 bacitracin-sepharose affinity chromatography로 부분정제하였고 합성기질 인 Bz-Pro-Phe-Arg-Nan로 효소의 활성을 측정하였다. 정제한 효소는 pH 7에서 최적 활성을 보였고 Dn를 넣었을 때에는 pH 6 및 pH 9이었다. 최적 온도는 $37^{\circ}C$이었지만 높은 온도에서도 활성이 나타났다. 정제한 효소는 cysteine계열의 저해제인 E-64, antipain, leupeptin에 의해, 그리고 $Hg^{2+},{\;}Zn^{2+}$ 이온에 의해 활성이 저해되었고. DTF와 cysteine에 의해서는 효소의 활성띠 2~3배 증가하였다. 등전점(pl)은 7.2이었고, gelatin SDS-PAGE에서 정제한 효소는 gelatin을 분해하였으나 cysteine계열 저해제인 I-64. iodoacetic acid(IAA), leupeptin, antipain과 반응한 후에는 gelatin을 분해하지 못하였고, PMSF나 EUfA는 영향을 미치지 못했다. 정제한 효소는 SDS-PAGE에서 분자량이 60 kDa이었고 면역이적법에서 면역 혈청과 반응하여 항원성을 나타내었다. 이상의 결과로 보아 60 kDa의 정제한 단백질 분해효소는 항원성을 갖는 cysteine계열 분해효소로 숙주-기생충 상호 관계에서 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
Hyun PARK;Man Young KO;Moon Kee PAIK;Ching Thack SOH;Jang Hoon SEO;Kyung-il IM
Parasites, Hosts and Diseases
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제33권3호
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pp.211-218
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1995
간흡충의 병원성과 단백분해효소 활성도의 상관성을 밝히기 위하여 간흡충 추출물과 분비배설물 의 단백분해효소 활성도와 세포독성을 평가하였고 분비배설물에서 단백분해효소를 부분정제하고 생화학적 성질을 규명하였다. 여러 가지 단백분해효소 억제제를 사용하여 단백분해효소의 활성을 측정한 결과 간흡충에는 Rf값을 서로 달리하는 효소분획으로 되어있음이 관찰되었으며. 이러한 효소 분획은 azocasein을 기질로 한 활성부위 잔기 억제 실험에서 서로 상이한 활성부위잔기를 갖고 있음을 알 수 있었다. 간흡충 분비배설물의 세포독성은 단백질 농도를 $120\mu\textrm{g}/ml$까지 증가시키자 세포독성이 3배 증가했고. 이 효과는 NEM과 ntipain에 의해 억제되었다. 이 사실은 cysteine 단백 분해효소가 세포독성에 관여하는 것을 보여주고 있었다 이 단백분해효소는 최적활성치가 pH 7.5 이었다. 이 효소를 분비배설물로부터 23배 정제하였고 이때 회수율은 14.5%이었다. 부분정제한 단백분해효소의 분자량은 24 kDa이었다. 이 효소는 NEM, antipain에 의해 효소활성이 억제되었고, 동시에 세포독성도 억제되었다. 이 사실로부터 부분정제한 효소의 활성부위잔기는 cysteine이고 이 효소가 또한 분비배설되어 세포독성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
본 연구에서는 단백질분해효소의 산업적 이용을 위하여 kiwifruit 과육 속에 들어 있는 gelatin분해활성을 조사하였다. Kiwifruit 과육에는 3개의 단백질분해효소의 활성 밴드(PI, PII, PIII)가 관찰되었다. 단백질분해효소 PI은 220 kD, PII는 51 kD, PIII는 26 kD에 해당하는 것으로 추정할 수 있었다. 이들 단백질분해효소 PI, PII, PIII는 모두 pH 2.0~5.0 범위에서 높은 활성을 보였으며 pH 4.0에서 가장 높게 나타났다. 이들 단백질분해효소 PI, PII, PIII는 모두 cysteine proteinase 저해제인 E-64와 iodoacetate에 의해서 저해되었으며, cysteine proteinase를 촉진하는 DTT, cysteine 및 $\beta$-mercaptoethanol에 의해서 활성이 증가하였다. 그 중 단백질분해효소 PIII는 분자량과 효소의 특성으로 보아 actinidin (EC 3.4.22.14)과 동일한 것으로 판단되었다. 단백질분해효소 PI, PII, PIII는 모두 $Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$과 $Mn^{2+}$에 의해 촉진되었으며 $Zn^{2+}$과 $Hg^{2+}$에 의해 완전히 저해되는 것으로 나타났다. 하지만, $Co^{2+}$, $Cu^{2+}$, $Al^{3+}$, $Fe^{3+}$ 등 금속이온의 영향이 다소 다르게 나타났다. Kiwifruit 과육의 단백질분해효소 PI, PII, PIII 중에서 PI과 PII는 온도가 증가함에 따라 활성이 점차 낮아졌으나 PIII는 비교적 안정한 것으로 조사되었다. 특히, PIII는 $50^{\circ}C$ 이내의 범위에서 48시간 경과시에도 75% 이상의 활성을 보여 이 범위의 온도에서는 상당 시간 동안 안정한 것으로 나타났다.
Tilapia 난과 혈청의 cysteine proteinase 저해제(cystatin)의 산업적 이용 적성을 평가하고자 이의 저온 저장성과 가열에 대한 열 안정성을 살펴보았다. Tilapia 난과 난의 균질 상등액을 $4^{\circ}C$에서 3일간 보관하면서 cystatin 활성도의 변화를 측정한 결과 난의 경우는 저장 중 큰 변화가 없었으나, 난 균질 상등액의 경우는 활성이 차츰 감소하여 저장 3일 후에는 초기 활성의 약 65%로 줄어들었다. 냉동과 해동에 따른 cystatin의 안정성을 살펴보기 위하여 난과 혈청을 $-20^{\circ}C$ 냉동과 상온 해동을 하루에 한 차례씩 반복한 결과, 난의 경우 5회 이상 냉동과 해동이 반복된 경우에는 활성이 차츰 감소하였으나, 혈청의 경우는 냉동-해동 cycle을 5회 반복하여도 cystatin 활성에 영향을 미치지 않았다. 난 cystatin의 열 안정성을 측정하기 위하여 $35^{\circ}C$와 $50^{\circ}C$에서 각각 30분간 가열하여 cystatin 활성을 측정한 결과 $35^{\circ}C$에서는 80% 이상의 활성이 유지되었으나 $50^{\circ}C$에서는 10% 미만으로 감소되었다. 반면에 혈청의 경우는 $50^{\circ}C$에서 30분 가열하여도 cystatin 활성이 감소하지 않고, $80^{\circ}C$의 고온에서 30분 동안 가열하여도 약 74%의 활성이 남아 있어 열에 매우 강한 특성을 보였다. 이상의 결과를 종합하면 난을 냉장저장할 때는 난을 파괴하지 않고 원상대로 보관하는 것이 난을 균질하여 원심분리한 상등액으로 저장하는 것보다 cysteine proteinase 저해제 활성을 더 오래 보존하는 방법이며, 난 cysteine proteinase 저해제는 냉동-해동 반복처리에도 비교적 안정하였으나 혈청은 난에 비하여 냉동-해동 반복처리에 대해 더욱 안정하였다. 열 안정성에 있어서는 난 cystatin은 열에 비교적 약한 반면 혈청 cystatin은 열에 매우 안정하였다. 따라서 tilapia 난과 혈청은 surimi 제조시 cysteine proteinase 저해제로서 활용가치가 있으며, 특히 혈청은 더욱 유용하다고 사료된다.
14년생 인삼의 뿌리로부터 cDNA library를 제작한 후 무작위로 뽑은 EST clone 중에서 cysteine proteinase(CP) 유전자에 높은 상동성을 나타내는 clone 6개를 선발하였고 이를 바탕으로 PgCysP1을 제작하였다. 인삼의 CP 유전자는 전장의 길이가 1,398bp로 366개의 아미노산을 코딩하는 1,101bp의 ORF를 가지고 있다. PgCysP1의 아미노산 서열과 이차구조를 분석한 결과, 기존에 보고된 식물들과 높은 상동성을 나타내었으며 PgCysP1는 papain family에 속하는 것으로 확인되었다. RT-PCR 분석결과, 인삼의 PgCysP1는 NaCl, 저온, wound, salicylic acid에 대해 그 발현 양상이 상동성을 나타내는 다른식물의 CP 유전자 발현과 유사한 양성을 보였고, 이에 PgCysP1은 CP gene으로 사료되며, 앞으로 인삼 식물체의 환경 스트레스에 대한 내성 연구가 요구된다.
We have cloned a cDNA encoding a cysteine proteinase of the Acanthamoeba healui OC-3A strain isolated from the brain of a granulomatous amoebic encephalitis patient. A DNA probe for an A. healui cDNA library screening was amplified by PCR using degenerate oligonucleotide primers designed on the basis of conserved amino acids franking the active sites of cysteine and asparagine residues that are conserved in the eukaryotic cysteine proteinases. Cysteine proteinase gene of A. healui (AhCPI) was composed of 330 amino acids with signal sequence, a proposed pro-domain and a predicted active site made up of the catalytic residues, $Cys^{25},{\;}His^{159},{\;}and{\;}Asn^{175}$. Deduced amino acid sequence analysis indicates that AhCPI belong to ERFNIN subfamily of C 1 peptidases. By Northern blot analysis. no direct correlation was observed between AhCPI mRNA expression and virulence of Acanthamoeba, but the gene was expressed at higher level in amoebae isolated from soil than amoeba from clinical samples. These findings raise the possibility that AhCPI protein may play a role in protein metabolism and digestion of phagocytosed bacteria or host tissue debris rather than in invasion of amoebae into host tissue.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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