• Journal of Microbiology
• /
• 제34권3호
• /
• pp.241-247
• /
• 1996

The stability of the genetically engineered microorganisms and their recombinant plasmids released in natural environments has been regarded as one of the molecular ecological topics. In this study, the recombinant plasmids pCU103 in which the pcbCD genes involved in biodegradation of biphenyl and 4-chlorobiphenyl were cloned in pBluescript SK(+) vector, were examined for their structural and functional stability in different waters at 15 $^{\circ}C$ by the methods of electrophoresis, Southern hybridization, quantification with fluorescent dye, and transformation. The recombinant plamids maintained their stabilities for about 30 days in sterilized distilled water (SDW), 15 days in autoclaved creek water (AW), 25 days in filtered and autoclaved non-sterile creek water (FAW), 4 days in Luria-Bertani (LB) broth, and less than one day in filtered non-sterile creek water (FW). The covalently closed circular (CCC) form of the plasmid was decreased and open circular (OC) form was increased as a function of incubation time, and then linear (L) form was produced to be ultimately degraded out. The degradation rates of the plasmid were proportionally correlated to trophic level of the water, and the biological factor such as DNases was found to be one of the most critical factors affecting structural and functional stability of the plasmid in non-sterile natural water.

• The Plant Pathology Journal
• /
• 제30권1호
• /
• pp.68-74
• /
• 2014

Chrysanthemum stunt viroid (CSVd), a noncoding infectious RNA molecule, causes seriously economic losses of chrysanthemum for 3 or 4 years after its first infection. Monomeric cDNA clones of CSVd isolate SK1 (CSVd-SK1) were constructed in the plasmids pGEM-T easy vector and pUC19 vector. Linear positive-sense transcripts synthesized in vitro from the full-length monomeric cDNA clones of CSVd-SK1 could infect systemically tomato seedlings and chrysanthemum plants, suggesting that the linear CSVd RNA transcribed from the cDNA clones could be replicated as efficiently as circular CSVd in host species. However, direct inoculation of plasmid cDNA clones containing full-length monomeric cDNA of CSVd-SK1 failed to infect tomato and chrysanthemum and linear negative-sense transcripts from the plasmid DNAs were not infectious in the two plant species. The cDNA sequences of progeny viroid in systemically infected tomato and chrysanthemum showed a few substitutions at a specific nucleotide position, but there were no deletions and insertions in the sequences of the CSVd progeny from tomato and chrysanthemum plants.

• Current Research on Agriculture and Life Sciences
• /
• 제5권
• /
• pp.52-58
• /
• 1987

효모(酵母)와 대장균(大腸菌)의 셔틀 벡터인 YIp5, YRp7, YEp13플라스미드를 S. cerevisiae DBY747을 수용세포(受容細胞)로 하여 원형질체 방법(方法)에 의해 형질전환(形質轉換)시킨 결과(結果), YIp5플라스미드는 형질전환체가 나타나지 않았으며, YEp13플라스미드는 DNA $10{\mu}g$ 당(當) $1.2{\times}10^3$, YRp7은 $1.0{\times}10^2$ 개(個)의 형질전환체를 얻었다. YIp5플라스미드와 YEp13플라스미드, 그리고 YIp5플라스미드와 YRp7플라스미드를 환상(環狀)플라스미드 상태(狀態)로 동시형질전환(同時形質轉換) 시켰을 때 각각 DNA $10{\mu}g$ 당(當) 210 및 95개(個)의 형질전환체를 얻었으며, 동일(同一) 부위(部位) 또는 다른 부위(部位)를 절단(切斷)한 선상(線狀)플라스크를 앞서와 같이 동시형질전환(同時形質轉換)시켰을때, 서로 비슷하게 DNA $10{\mu}g$당(當) 15~85개(個)의 형질전환체를 얻을 수 있었다. 이러한 결과(結果)에서 볼때 수용세포(受容細胞)를 S. cerevisiae DBY747로한 동시형질전환(同時形質轉換)에서 환상(環狀)플라스미드간(間)의 형질전환(形質轉換)이 선상(線狀)플라스미드간(間)의 형질전환(形質轉換)보다 빈도(頻度)가 높으며 선상(線狀)플라스미드간(間)의 형질전환(形質轉換)에서 미단(未端) 부위(部位)의 상이(相異)함이 큰 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 형질전환체의 안정성(安定性)에 있어서는 YIp5플라스미드와 YEp13플라스미드간(間)의 형질전환체가 YIp5플라스미드와 YRp7플라스미드간(間) 형질전환체에 비(比)해 안정(安定)하게 나타났는데, 이는 stringent control을 받는 ARS유전자(遺傳子)를 가진 YRp7플라스미드보다 $2{\mu}m$ DNA 복제(複製) 기점(起點)을 가진 YEp13플라스미드의 복제수(copy number)가 많기 때문인 것으로 생각된다.

• 한국수정란이식학회:학술대회논문집
• /
• 한국수정란이식학회 2006년도 The 6th Intermational Symposium on Developmental Biotechnology
• /
• pp.36-37
• /
• 2006

• 한국자원식물학회지
• /
• 제24권2호
• /
• pp.130-138
• /
• 2011

본 연구에서는 열수 팥 추출물이 hydroxyl 라디칼에 의해 유도되는 산화적 스트레스에 미치는 영향을 알아보기 위하여 항산화활성과 DNA 및 세포의 산화적 손상 억제 효과를 조사하였다. 팥 열수 추출물의 DPPH 라디칼과 hydroxyl 라디칼의 제거능은 다소 낮았으나, $Fe^{2+}$-chelating과 과산화수소 제거효과는 높게 나타나 활성산소의 생성을 억제하는 데 효과적인 것으로 확인되었다. 또한 팥 열수 추출물의 in vitro DNA cleavage, DNA migration 및 H2AX의 인산화비 억제활성은 높은 활성을 보여주고 있어 라디칼에 의한 DNA 손상 억제에 효과적으로 작용하였다. 또한 지질과산화와 p21의 발현율을 통해 세포의 산화적 손상에 미치는 영향을 살펴보면 지질과산화 억제능과 p21의 발현율에 매우 효과적으로 작용하고 있어 라디칼에 의한 산화적 스트레스로부터 세포를 보호할 것으로 생각된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제31권1호
• /
• pp.8-15
• /
• 2021

More and more available fungal genome sequence data reveal a large amount of secondary metabolite (SM) biosynthetic 'dark matter' to be discovered. Heterogeneous expression is one of the most effective approaches to exploit these novel natural products, but it is limited by having to clone entire biosynthetic gene clusters (BGCs) without errors. So far, few effective technologies have been developed to manipulate the specific large DNA fragments in filamentous fungi. Here, we developed a fungal BGC-capturing system based on CRISPR/Cas9 cleavage in vitro. In our system, Cas9 protein was purified and CRISPR guide sequences in combination with in vivo yeast assembly were rationally designed. Using targeted cleavages of plasmid DNAs with linear (8.5 kb) or circular (8.5 kb and 28 kb) states, we were able to cleave the plasmids precisely, demonstrating the high efficiency of this system. Furthermore, we successfully captured the entire Nrc gene cluster from the genomic DNA of Neosartorya fischeri. Our results provide an easy and efficient approach to manipulate fungal genomic DNA based on the in vitro application of Cas9 endonuclease. Our methodology will lay a foundation for capturing entire groups of BGCs in filamentous fungi and accelerate fungal SMs mining.

• Bulletin of the Korean Chemical Society
• /
• 제32권5호
• /
• pp.1669-1678
• /
• 2011

Six new binuclear copper(II) complexes have been prepared by template condensation of the dialdehydes 1,8-[bis(3-formyl-2-hydroxy-5-methyl)benzyl]-l,4,8,11-tetraazacyclotetradecane (PC-a) and 1,8-[bis(3-formyl-2-hydroxy-5-bromo)benzyl]-l,4,8,11-tetraazacyclotetradecane (PC-b) with appropriate aliphatic diamines, and copper(II) perchlorate. The structural features of the complexes have been confirmed by elemental analysis, IR, UV-vis and mass spectra etc. The electrochemical behavior of all the copper(II) complexes show two irreversible one electron reduction process. The room temperature magnetic moment studies depict the presence of an antiferromagnetic interaction in the binuclear complexes. The catechol oxidation and hydrolysis of 4-nitrophenylphosphate were carried out by using the complexes as catalyst. The antimicrobial screening data show good results. The binding of the complexes to calf thymus DNA (CT DNA) has been investigated with absorption and emission spectroscopy. The complex [$Cu_2L^{1a}$] displays significant cleavage property of circular plasmid pBR322 DNA in to linear form. Spectral, electrochemical, magnetic and catalytic studies support the distortion of the copper ion geometry that arises as the macrocyclic ring size increases.

• Current Research on Agriculture and Life Sciences
• /
• 제4권
• /
• pp.36-41
• /
• 1986

대장균(大腸菌)과 효모(酵母)의 셔틀 벡터인 YIp, YRp, YEp를 S. cerevisiae MC 16, DBY747에 형질전환(形質轉換)시켰다. 이들 벡터들을 대장균(大腸菌)에 형질전환(形質轉換)시켰을 때 그 빈도(頻度)가 YIp5, YIp26, YEp13, YRp7에서 각각 $5.1{\times}10^{-4}$, $1.5{\times}10^{-3}$, $3{\times}10^{-3}$, $1.3{\times}10^{-3}$으로 나타났다. YEp13을 MC16과 DBY747에 Ito 법(法)으로 형질전환(形質轉換)시켰을 때 MC16, DBY747에서의 빈도(頻度) 각각 $3.3{\times}10^{-4}$, $1.2{\times}10^{-4}$으로 나타났다. DBY747을 수용세포(受容細胞)로 하여 YRp7과 YIp26을 환상(環狀)으로 각각 형질전환(形質轉換)시켰을 때 그 빈도(頻度)는 각각 $3{\times}10^{-6}$, $6{\times}10^{-8}$이하로 나타났다. DBY747을 수용세포(受容細胞)로 하여 YEp13과 YIp26을 선상(線狀)으로 절단하여 $Li^+$ 처리(處理)한 S. cerevisiae에 cotransformation을 하였을 때 YIp26+YEp13 ($Leu^+$, $Ura^+$)의 cotransformant는 $1{\times}10^{-5}$ 빈도(頻度)가 나왔으며 YIp26과 YEp13에 대한 각각의 빈도(頻度)는 $10^{-7}$ 이하, $5{\times}10^{-5}$ 빈도(頻度)로 나타났다. 또 YIp5와 YEp13, YIp26과 YRp7을 원형질체화(原形質體化)한 S. cerevisiae DBY747에 cotransformation 하였을 때 빈도(頻度)는 YIp5+YEp13은 $4{\times}10^{-6}$으로 나오고 YIp26+YRp7에서 $1.5{\times}10^{-6}$으로 나타났다.

• 농약과학회지
• /
• 제18권3호
• /
• pp.202-209
• /
• 2014

RNA interference(RNAi)는 살아있는 세포 내에서 유전자의 표현 형을 억제하는 작용을 하고 Chitinase는 곤충이 탈피를 하는 동안 오래된 큐티클의 분해와 재흡수를 도와주는 효소로 알려져 있다. 이러한 작용기작을 이용하는 연구를 수행하기 위하여 담배거세미나방의 chitinase와 관련하여 탈피저해 효과를 조사하였다. 담배거세미나방 5령 유충으로부터 RNA를 추출하고 이용하여 cDNA를 합성하고 약 700 bp의 chitinase를 증폭 하였다. 증폭한 PCR product를 pGEM T-easy vector에 cloning하여 competent cell (E.coli)에 형질전환 시키고 mixture를 배양 후 colony를 선발하고 plasmid DNA를 추출하였다. 그 결과 약 3 kb size의 vector band와 약 700 bp의 insert band를 확인 할 수 있었다. dsRNA를 합성하기 위해 각각의 DNA를 Spe I과 Nco I의 제한 효소 처리를 하여 linear form의 DNA로 만들었다. dsRNA 합성 후 약 $10{\mu}g/{\mu}l$의 농도로 $5{\mu}l$씩 담배거세미나방 4령 유충에 주입하였다. 그 결과 유충-유충간의 탈피에서는 기형발육, 탈피저해, 표피의 색소 변이가 나타났다. 번데기-성충 간의 탈피에서는 탈피저해, 날개변이, 기형발육 현상을 볼 수 있었다. 용화율의 경우 무처리구 83.3%, DW 처리구 78.3%, dsRNA 처리구 66.7%로 나타났다. 우화율의 경우 무처리구 90.0%, DW 처리구 72.3%, dsRNA 처리구 65.0%로 나타나 dsRNA를 처리한 그룹에서 상대적인 탈피 저해 효과를 확인할 수 있었다. 그러나 변이율의 경우 무처리구 8.9%, DW 처리구 2.9%, dsRNA 처리구 19.2%로 dsRNA를 주입한 처리구에서 변이율이 가장 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 표현형적 변이는 dsRNA 주입 후 약 18 시간 이후부터 뚜렷하게 나타나는 것을 볼 수 있었다.