최소 생산배지에 포함된 25mM 이상의 무기인(Inorganic phosphate)은 Cephalosporium acremonium의 생육은 증대시켰으나, cephalosporin C(CPC) 생산은 감소시켰다. Phosphate-starved 휴지세포계를 이용하여 균체내의 ATP, ADP와 AMP를 측정하였다. 그 결과로부터 무기인은 adenylated nucleotide의 농도의 비율로 표시되는 energy charge를 조절하여 CPC 생산성에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. 또한, 무기인에 의한 CPC 생합성은 repression 효과에 의한 것이 아니라 inhibition 효과에 의해 조절받는 것을 알 수 있었다.
Cephalosporium 배양시 균체의 형태학적 측면을 고려한 cephalosporin C 생합성에 대한 모델식을 제안하였다. 제한기질로 glucose와 methionine을 고려한 double-substrate 모델을 설정하였는데 여기서 glucose는 균체의 증식 정도를, methionine은 균체의 증식속도를 제어하게 된다. Cephalosporin C의 생산은 균체의 형태학적 분화와 밀접한 관계가 있다. 한편 cephalosporin C의 생산성을 증대시키기 위해 모델식을 유가식 배양에 응용하였다.
회분배양과 유가배양을 이용하여 호알칼리성 Cephalosporium sp. RYM-202로부터 alkaline carboxymethyl cellulase (CMCase)와 Xylanase의 생산을 위한 배양조건에 대하여 조사하였다. 조사한 탄소기질 중에서 밀기울이 두 효소의 생산에 가장 효율적이었다. 또한 CMCase는 carboxymethyl cellulose (CMC)를 탄소기질로 첨가한 배양액에서, 반면에 xylanase의 경우에는 xylan을 기질로 하였을 때 높은 생산량을 나타냄으로서 유도기질 특이성을 보였는 바, 이 결과는 Cephalosporium sp. RYM-202에서의 CMCaee와 xylanase의 생합성이 효소 유도 수준에서 독립적으로 조절됨을 시사해 준다. 조사된 질소원 중에서는 무기질소원인 $NaNO_3$가 효소생산에 효과적이었으며, 이들 효소의 최대 생산을 위한 배양온도와 pH는 각각 $20^{\circ}C$와 9.0인 것으로 나타났다. 한편, 발효조에서의 회분배양을 통한 효소생산의 경우, 밀기울의 농도를 5%까지 증가시킴에 따라 효소생산량은 증가되었으나 catabolite repression에 의해 효소생산의 지연과 생산력의 감소를 초래하였다. 이러한 문제점은 탄소원의 간헐적 공급에 의한 유가배양을 통해서 어느 정도 해결될 수 있는 것으로 나타났으며, 밀기울의 최종농도가 5% 되게 공급된 유가배양 시 CMCase와 xylanase의 최대 효소생산량은 각각 0.39 및 9.2 units/ml 이었으며, 이는 같은 농도의 밀기울을 함유하는 회분배양 시 획득된 효소활성에 비해 각각 1.22배와 1.36배 증가된 것이다.
DL-seleno-methionine에 내성을 갖는 변이주, Cephalosporium acremonium MS-92는 무기황과 메치오닌의 Uptake rate가 모균보다 우수하였으며, 세포내에 과량의 메치오닌과 S-adenosylmethionine (SAM)을 축적하였다. 또 C. acremonium에서 무기황의 uptake rate는 시스테인에 의해 크게 저해되었다. Crude enzymes extracts에서 변이주 MS-92 는 cell내에 cysteine을 적게 형성하였다 즉, L.-serine sulfhydrylase 활성이 모균보다 낮았으며 세포내에 시스테인의 양을 간접적으로 알 수 있는 시스테인 분해효소인 cysteine desulfhydrylase 활성치 변이주에는 모균의 약 반이였다. 이상의 결과에서 C. acremonium에서 메치오닌을 만드는 효소들의 조절에는 A. nidulans와 비슷하게 시스테인이 관여한다는 것을 추측할 수 있었다.
YIp5를 사용하여 Cephalosporium acremonium ATCC 2033으로부터 Saccharomyces cerevisiae SHY3에서 발현되는 자율복제 기점 (ARS)를 분리하였다. 자율복제 기점을 갖는 40종의 vector 가운데 가장 안정성 (stability)이 높은 plasmid를 pCY-2라 명명하였으며 pCY-2는 C.acremonium에서 유래하는 3.7kb의 단편을 갖고 있었다. 또 Southern hybridization과 재형질전환을 통해 pCY-2가 효모내에서 자율적으로 복제되고 있다는 것을 확인하였다. 또한 pCY-2는 형질전환율과 안정성에 있어 효모의 ARS를 갖는 YRp7 vector보다 우수하였다.
Kim Jong Chae;Lim Jung Soo;Kim Jung Mo;Kim Chongyoup;Kim Seung Wook
Korea-Australia Rheology Journal
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제17권1호
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pp.15-20
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2005
In this study, the relationship between morphology and viscosity of the main culture broth of Cephalosporium acremonium M25 was investigated in a 2.5 L bioreactor. The differentiation of C. acremonium M25 showed a complex pattern during the main culture. The morphological changes of C. acremonium M25 were related to the rheological properties of the culture broth and it was well agreed with the power law model. As a result of rheology study, it was found that rheological properties of the main culture broths of C. acremonium M25 in bioreactor were closely related to morphological changes. Also, fractal dimension fairly predicted morphological and rheological changes in the main culture broth.
A transformation system mediated by Agrobacterium tumefaciens is routinely used for the genetic engineering of plants. Here, we report an efficient and stable method for transformation of heterogeneous genes into an industrial Cephalosporium acremonium by using a similar transformation system established in plants. Both the phleomycin-resistant gene and vgb gene were used as screening markers to confirm the success of transformation by either Southern hybridization or PCR amplification. It was found that acetosyringone (AS) was necessary only for protoplast transformation and the heterogeneous genes transferred were integrated into the genome of C. acremonium. The transformation efficiency obtained with this system was much higher than the conventional techniques used for transformation of C. acremonium.
토양으로부터 cellulase compoenets를 생성할 수 있는 호알칼리성균 Cephalosporium sp. RYM-202를 분리하였다. 이 균의 생장을 위한 배지의 최적 pH는 9.0이었으며, pH 9.5-10.0의 배지에서 최대의 효소생산이 일어났다. Cephalosporium sp. RYM-202의 배양 여액으로부터 DEAE-Sephadex A-50 이온교환 크로마토그라피와 Sephadex G-150 gel filtration 크로마토그라피에 의해 부분정제된 세개의 CMCases(P-I-1, P-I-II 및 P-II-I)를 획득하였다. 효소활성을 위한 최적 pH는 P-I-I이 7.5, P-I-II는 8.0-9.5, P-II-I은 7.5-10.0이었으며, 모두 4.5-12.0의 pH 범위에서 안정한 것으로 나타났다. 세 CMCases 활성의 최적온도는 $40-60^{\circ}C$ 범위이었으나, P-I-I 및 P-II-I의 경우에는 $20^{\circ}C$에서도 최고활성의 50% 이상을 유지하였다. 또한 이 CMCases는 세제조성물로 사용되고 있는 여러가지 계면활성제, 착화합물 및 단백질가수분해효소에 대하여 안정성이 높은 특징을 보였다.
Using cephalosporium acremonium ATCC 14553, we studied on the important factors in fermentation. Those factors were :carbon and nitrogen sources, methionine effect, absorbent effect, fermentation variables in a batch fermentation variables in a batch fermentation, effect of reuse of its cellular biomass as a reusable nutrient, and 2, 4-dinitrophenol effect on cephalosprin C production.
호알카리성 진균 Cephalosporium sp. RYM-202가 생산하는 alkaline xylanase (CX-III)의 작용에 의해 xylan 기질로부터 생성되는 주요 가수분해 산물은 xylobiose와 중합도가 4이상인 xylooligosaccharides이었다. 이 효소는 xylobiose에 대한 분해능을 가지고 있지 않지만 xylotriose로부터는 xylobiose를, xlyotetraose로부터 xylobiose와 xylotriose를 주산물로 형성하였다. 이러한 결과들은 CX-III가 transglycosidase 활성을 소유하는 전형적인 endo-type xylanase임을 보여준다. N-bromosuccinimide에 의한 CX-III의 화학적 변환 실험결과 효소 1분자 당 2개의 tryptophan 잔기가 활성에 관여하는 것으로 나타났다. 그러나 iodoacetamide 및 diethylpyrocarbonate에 의한 효소활성의 저해효과는 나타나지 않음으로써 이 효소의 활성부위에 cysteine과 histidine 잔기가 필수적이지 않음이 확인되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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