• KSBB Journal
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• 제24권4호
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• pp.403-409
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• 2009

본 연구에서는 H2AX의 생리학적인 기능 및 분자세포 생물학적 기전 해석에 대한 보다 명확한 정보를 제시하고자, H2AX 관련 단백질들을 literature review 및 생물정보학적인 기술을 이용하여 최적의 결합 단백질체를 40개를 예측하곤 이들 가운데 상호작용 가능성이 높은 BRCA1와 BARD1 단백질을 선별하여 in vitro 결합실험을 통해 이를 증명하였다. 이들 두 가지의 유전자를 발굴하여, 클로닝하였다. 클로닝된 유전자를 이용하여 두 가지 단백질을 발현 및 정제하였으며, 단백질들의 자체적인 구조에 의한 결합능력을 판단하기 위해 in vitro binding assay법을 실시하였다. 단백질의 구조적 안정과 비특이적 결합을 억제하는 detergent만이 포함된 상태에서, 구조학적 및 물리학적 상호 결합의 유무를 판정할 수 있게 하였으며, BRCA1과 BARD1은 모두 H2AX에 결합함을 확인하였다. 이런 실험결과를 바탕으로 각각의 단백질에 대해 H2AX와의 최적 결합 부위를 알아내기 위해 각 유전자의 domain을 생물정보학적으로 분석하였다. 이에 RING domain, NES, NLS 및 BRCT domain에 해당하는 유전자 부분을 새로 클로닝하여, 다시 in vitro 결합실험 및 실험결과에 대한 literature review를 통한 분석을 실시한 결과, H2AX는 BRCA1의 NLS, BARD1의 BRCT domain 부분과 결합하는 것을 확인하였다. H2AX에 대한 BRCA1과 BARD1과의 결합은 DNA repair에 있어 BRCA1의 NLS와 BARD1의 BRCT domain을 통해 H2AX foci의 관련 세포 신호전달 기전에 중요한 역할을 하여 전체적으로 genomic stability에 영향을 미칠 가능성이 농후할 것으로 사료된다.

• 생명과학회지
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• 제16권2호
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• pp.315-322
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• 2006

신경세포 간 정보교환이 이루어지고 있는 신경전달물질의 방출과정은 극히 복잡하여, 이 방면의 독창적인 연구를 수행하기 위해서는 신규작용을 갖는 특이적인 저분자 probe의 탐색은 필수적이다. PC12세포에 tritium-label된 norepinephrine ($[^3H]-NE$)을 incorporation시킨 후에 60 mM의 고농도의 $K^+$의 자극에 의해서 탈분극 후에 방출되는 $[^3H]-NE$의 양을 scintillation countering하여 생리 활성 물질을 탐색하기 위한 in vitro의 실험계를 세웠다. 이 탐색계를 이용하여 곰팡이, 방선균와 박테리아의 대사산물 1만 1000여 샘플을 탐색한 결과, PC12세포에서 고농도의 $K^+$의 자극에 의해서 탈분극 후에 유도되는 $[^3H]-NE$의 방출을 효과적으로 저해하는 FS11052를 방선균 유래의 대사산물로부터 얻었다. FS11052는 또한 PC12세포와 rat cortical neurons에서 동일한 고농도의 $K^+$의 자극에 의한 탈분극 후에 유도되는 신경전달 물질로서 ATP의 방출에도 유의한 저해효과를 나타냈으며, 이 저해 효과는 ionopore로 알려진 ionomycin ($1{\mu}M$)을 포함하는 저농도의 $K^+$의 버퍼를 처리하였을 때에도 보여졌다. 이틀 결과로부터 FS11052의 신경전달 물질의 방출에 대한 저해작용은 세포내 $Ca^{2+}$ 유입 이 후의 반응으로 추정하며 이 작용기구에 대한 해석을 하기위하여, 신경세포의 돌기신장 형태에 대한 영향을 관찰한 결과, 분화를 유도하는 적정 농도인 $5{\mu}g/ml$의 NGF 존재 하에서의 PC12 세포의 돌기 신장에 대하여서는 억제작용을 나타냈다. 또 rat의 대뇌 해마 세포에 대하여 특정적인 형태의 돌기를 내고 있어, FS11052 물질의 첨가에 의해 통상의 긴 축색돌기는 억제되고 얇은 침상의 돌기가 세포체로부터 돌출되어 있었으며, growth cone 를 갖고 있지 않은 뉴우런이 많이 관찰되었다. FS11052 물질의 작용에 관해서는, 탈분극된 synaptic membrane이 $Ca^{2+}$ 이온을 유입 후 활성화되어 신경전달물질을 방출에 중요한 역할을 하고 있는 synaptotagmin, syntaxin, synapsin, SNAP25 등의 synaptosome을 구성하는 단백질에 직접 혹은 이와 밀접한 관련을 갖고 있는 인자와 간접적으로 작용하며, 신경전달물질의 방출을 억제하여 growth cone의 전향과 신경세포의 가소성을 조절하는 물질로 사료되어, 이 물질이 $Ca^{2+}$ 이온을 유입 후 일어나는 exocytosis와 신경계의 기능연구를 위해 사용되어질 수 있을 것으로 기대된다.