본 연구는, catabolic repression시킨 효모세포를 완전배지와 최소배지에서 derepression시켜, 배양시기 및 인산 첨가농도(free, limited, sufficient)에 따른 5종의 다당류 합성변화를 조사하였다. 그리고 다당류 합성과 무기폴리인산 축적량 및 인지질 합성 사이의 상관지수를 구하여 합성시 관련되는 유의한 정도를 검정하였다. 그 결과, 최소배지에서 catabolic derepression시킨 효모세포가, 완전배지에서 derepression시킨 세포에 비하여, glycogen의 합성이 발리 그리고 많이 일어났고, acid soluble glycogen type이 주된 함량을 나타내었으며, alkali soluble glycogen은 당이 많이 소모된 24시간 배양 후에 소량 나타났다. 무기인산 첨가정도에 따라 total glycogen합성이 일정한 비율로 빨리 그리고 높게 일어났다. Glucan의 합성에는 ALPase 중 ALPase "C"가 관련할 것으로 추정되었다. Mannan은 ezponential phase초기와 정체기때, acid soluble 분획은 정체기때 최대함량을 나타내었다. Mannan 합성과 poly-P "C"축적량 사이의 상관지수는 0.866, mannan합성과 인지질 사이의 상관지수는 0.726으로 나타나 매우 유의하였다.
이 연구는 효모 세포를 catabolic repression과 derepression시켰을 때, poly-P 합성 및 분해에 직접 관련된 tripoly-Pase와 poly-Pase의 활성도 동태를 조사하여 세포내 인산 대사 조절양상을 해석하고자 하였다. 또 TLC 방법을 통하여 무기 폴리인산을 분석하고, 배양시기 및 인산 첨가배양에 따른 무기폴리인산의 세포내 축적 상태, 세포내 위치, 전환과정을 조사하기 위해 염색을 통한 volutin 과립의 세포학적 관찰을 행하였다. Tripoly-Pase 활성도는 catabolic repression시킨 세포에서 derepression된 세포에 비하여 6배 이상 증가하였으며, poly-Pase 활성도는 산 불용성 무기폴리인산인 poly-P-"B"가 최대 축적량을 나타날 시기에 최대의 활성도를 보였다. Linear poly-P의 분석에서는 tripoly-P가 주로 검출되었고 n>8이상인 poly-P가 다량 검출되었다. catabolic derepression시킨 세포에서 volutin과립의 형성을 세포학적으로 관찰하였을 때, 세포벽에 존재하는 산 불용성 무기 폴리인산이 우선적으로 합성되었으며, 배양함에 따라 세포질, 핵 또는 액포로 전이되었다.
The present study was designed to investigate cellular regulation of phosphate metabolism between catabolically repressed and derepressed states in yeast (Saccharomyces uvarum). The activities of various phospatases and the contents of phosphate compounds were detected according to the culture phase and various phosphate concentrations. As the results, Saccharomyces uvarum derepressed many phosphate metabolizing enzymes such as alkaline phosphatase, acid phosphatase and ATPase more than ten fold simultaneously during catabolic repression (phospgate and sugar starvation). At the same state, the amounts of orthophosphate, nucleotidic labile phosphate and acid soluble polypgosphate were increased, compared to basal levels of normally cultivated cells. $Mg^{++}-stimulated$ type among all phospatases was appeared to have most of the enzyme activity. It could be postulated that $K^+ -stimulated$ alkaline phosphatase was directly or indirectly correlated with the synthesis of acid insoluble polyphosphate $Mg^{++}-stimulated$ phosphatase with the degradation of polyphosphates. In case of cultivation in the medium supplemented with sugar and phosphate (catabolic derepression), phospgatase activities except for alkaline phosphatase were decreased rapidly through the progressive batch culture, After 12 hrs culture, at early exponential phase, the cellular accumulation of acid insoluble polyphosphate increased about 5 fold, compared to those of the starved cells. Under catabolic repression, it could be postulated that intracellular phosphate metabolism was regulated by derepressions of phosphatases. The function of polyphosphate system was shown to compensate the ATP/ADP system as phosphate donor and energy source especially during catabolic repression.
Phenylacetic acid (PAA) is produced by many bacteria as an antifungal agent and also appears to be an environmentally toxic chemical. The object of this study was to detect PAA using Pseudomonas putida harboring a reporter plasmid that has a PAA-inducible promoter fused to a green fluorescent protein (GFP) gene. Pseudomonas putida KT2440 was used to construct a green fluorescent protein-based reporter fusion using the paaA promoter region to detect the presence of PAA. The reporter strain exhibited a high level of gfp expression in minimal medium containing PAA; however, the level of GFP expression diminished when glucose was added to the medium, whereas other carbon sources, such as succinate and pyruvate, showed no catabolic repression. Interestingly, overexpression of a paaF gene encoding PAA-CoA ligase minimized catabolic repression. The reporter strain could also successfully detect PAA produced by other PAA-producing bacteria. This GFP-based bioreporter provides a useful tool for detecting bacteria producing PAA.
In Serratia marcescens, acetolactate produced by the catabolic acetolactate synthase (ALS) is converted into acetoin, its physiological role of which is to maintain intracellular pH homeostasis. In this study, the expression mode of catabolic ALS by aeration and branched-chain amino acids was examined by the ELISA method. The amount of catabolic ALS decreased approximately 93% under aerobic conditions. We also showed that the expression of catabolic ALS decreased approximately 34 % and 65 % in the presence of 2.5 mM and 10 mM leucine, respectively. The repression of catabolic ALS by leucine has not been reported previously. In contrast to leucine, catabolic ALS levels increased approximately 13% and 38% by treatment with 2.5 mM and 10 mM isoleucine, respectively, while valine alone did not have any significant effect on the synthesis of catabolic ALS. The amount of catabolic ALS was also reduced to approximately 32% and 45% in the presence of 10 mM Leu+Ile and Leu+Ile+Val, respectively. The regulatory mode of the Serratia catabolic ALS suggests that catabolic ALS may also have a role in supplying acetolactate as an intermediate of valine and leucine biosynthesis in addition to the maintenance of internal pH.
본 연구는 효모세포 (Saccharomyces uvarum)의 ACPase, ALPase의 Isoenzyme type을 규명함과 아울러, iso-enzyme type중 어느 것이 constituitive 또는 repressible enzyme type인가를 조사하고, 각각의 isoenzyme활성도 비율을 살펴보아 배양조건(catabolic repression and derepression) 및 무기인산 제한에 따른 각 type의 세포내 조절기능을 분석하고자 하였다. Acid phosphatase는 또 다른 isoenzyme type이 발견되지 않았으나, alkaline phosphatase의 경우는 3가지 type이 p-NPP에 specificity를 지녔다. 세포질의 수용성단백질 분석결과 exponential phase의 세포는 주로 음전하를 띤 단백질이 높은 함량을 나타내었다. 당과 인산이 결핍된 배지에서 생육권(catabolic repression)세포에서 AL P Pase isoenzyme 중 type “B"의 활성도가 매우 높아졌으나, 완전배지에서 배양된 (catabolic derepression)세포에서는 type “B"의 활성도 감소 및 type “C"의 활성도 증가 현상을 볼 수 있었다. ALPase 중 “A" peak는 constituitive enzyme, “B" peak는 repressible enzyme, peak “C"는 L-histidinol phosphatase로 추정되었다.
효모 세포(S. uvarum)를 재료로 하여 배양 시기 및 sugar starvation시기에 특이하게 출현 또는 유도되는 RNase의 localization과 특성을 조사하고자 하였다. 정상 배양 시기 및 sugar starvation시킨 효모 세포를 세포 분획구에 따라 RNase 활성도를 측정하는 한편 ribosome 양의 변화를 조사하였다. 특히 ribosomal 분획구에서 추출한 RNase들을 poly(C)와 반응시킨 후 생성물을 TLC에 적응하여 효소의 특성 및 유도 여부를 조사하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 세포 분획구 중 $45,000{\times}g$ pellet 분획구 및 Postribomosal 분획구에서는 배양 시기나 sugar starvation에 관계없이 RNase의 활성도는 유의하게 증감하지 않았으나, ribosomal 분회구에서는 정체기와 sugar starvation시 활성도가 각각 2배, 10배 이상 급격히 증가하였다. ribosome의 양적 동태를 살펴보면 early log phase의 세포에 비하여, 정체기 세포와 sugar starvation시킨 세포에서는 $1/3{\sim}1/6$까지 급격히 감소하였다. TLC의 결과 rRNase의 종류는 early log phase에서는 oligonuclease와 3'-ribonuclease, 5'-ribonuclease,stationarf phase에서는 oligonuclease, 3'-ribonuclease, sugar starvation 시켰을 때는 3'-ribonuclease, 5'-ribonuclease의 활성이 나타났다. 그리고 완전 배지를 사용한 효모 세포에서는 공통적으로 oligonuclease의 활성이 나타난 반면, sugar starvation시킨 효모 세포에서는 oligonuclease의 활성은 나타나지 않았다.
고온성이며 호알칼리성인 Bacillus sp. TA-11이 생성하는 Invertase의 생합성 조절 기작을 규명하고자 먼저 이들의 유도와 억제에 관하여 검토하였다. Invertase는 10mM sucrose을 함유한 생합성 조절배지에서 3시간에 효율적으로 유도되었고 glucose는 sucrose에 의한 invertase 유도를 inducer exclusion 방식으로 억제시켰다. CAMP의 첨가로 glucose에 의한 catabolic repression이 다소 줄어들었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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