• 한국가축번식학회지
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• 제24권3호
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• pp.299-309
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• 2000

본 연구는 한우 체외수정란의 정확한 성판별을 위한 PCR의 적정조건을 검토하였고, Y 염색체 특이적 DNA primer(BOV97M : 141bp)와 소 특이적 DNA primer(216bp)를 이용한 2단계 PCR 방법으로 체외수정란의 발육속도에 따른 성판별율과 성비를 검토하였다. PCR 기법을 이용한 한우 체외수정란의 성판별은 Y 염색체 특이적 DNA primer와 소 특이적 DNA primer로 정확히 성을 판별할 수 있었으며, 웅성 수정란의 경우 141bp와 216bp에서 band가 나타났고, 자성 수정란의 경우 216bp에서 band가 나타났다. 한우 체외수정란의 경우 성판별 정확도를 높이기 위하여 투명대의 제거가 필요하며, 수정란의 DNA 추출방법에 따른 Y 염색체 특이적 band의 출현율은 Proteinase K와 반복 동결융해방법이 각각 45.2 및 53.3%로 나타났다. DNA의 양에 따른 성판별율은 zona free인 경우는 2$\mu$1와 10$\mu$1에서 각각 97.2%와 92.2% 였으며, zona intact의 경우는 12$\mu$1와 13$\mu$1에서는 각각 91.5%와 93.6%로서 zona free 수정란의 경우 2$\mu$1, zona intact의 경우 13$\mu$1의 DNA 양으로 성판별이 가능하였다. 한편, PCR 기법에 의한 한우 체외수정란의 성판별율은 96.0%였으며, 정확히 성판별을 할수 없는 비율은 4.0%였다. 성판별 수정란의 자성과 웅성의 비율은 46.3%와 49.7%로서 성비는 1.1:1이였으며, 발육단계간 자웅성비는 커다란 차이가 인정되지 않았으며, 발육단계가 진행될수록 성판별 정확도가 증가하였다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제11권3호
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• pp.283-289
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• 1996

This study was carried out to determine the sex of genomic and embryonic DNA using polymerase chain reaction(PCR). Bovine specific(216bp) and Y chromosome speicific DNA primers(l4lbp) were synthesized and tested for sexing. Bovine embryos used in this study were produced by in vitro fertilization. Few blastomeres for PCR were bisected by nicromanipulator and demi -embryos were cultured in TCM 199 medium containing 0.1% of solcoseryl. The results obtained were as follows; 1. Average optical density of genomic DNA extracted from blood of Hanwoo was 1.79$\pm$ 0.14. 2. 2. The ratio of the demi-embryos developed to blastocyst was 62.1 and 81.9% in morula and blastocyst, respectively. 3. When DNA of 2~4, 5~10 and more than 11 blastomeres was amplified with Y chromosome specific DNA primer by PCR, appreance rate of Y specific DNA band was 16.7, 46.2 and 40.0%, respectively. At least 5 to 10 blastomeres were required to determine the sex of embryos. 4. The rate of demi-embryos developed to blastocyst was 73.3% in TCM 199 medium supplemented with 0.1% solcoceryl. but 55.6% in control.

• 한국수정란이식학회지
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• 제11권2호
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• pp.145-150
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• 1996

This study was conducted to detect the Y-specific DNA in the blood of the female calf in bovine heterosexual production. Genomic DNAs of the freemartin were isolated from the blood and amplified with Y-chromosome specific DNA primer(l4lbp). In order to estimate the lower limit for the detection of XY cells, blood from a hull was diluted in cow blood to 0.01%. DNA sequencing on the PCR products was shown the same sequences as Y chromosome DNA of the normal cows. The Y specific DNA hand by PCR was detected all blood of female calf suspected to have bovine freemar tin syndrom and the karyotyping with freemartin blood was identified as XX / XY chimerism. Therefore, the PGR methods used in this study was very useful technique for the detection of freemartin in Ranwoo and Holstein.

• 한국축산식품학회지
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• 제27권3호
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• pp.351-356
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• 2007

본 연구는 포유류의 Y-염색체상에 존재하는 SRY 및 ZFY의 웅성 특이적 성 결정 유전자를 이용하는 PCR 기법으로 쇠고기 성판별 기술을 개발하고자 수행하였다. 성 결정 유전자 영역의 특정 염기서열을 포함하는 primer를 각각 설계 합성하고 이들 primer를 이용하여 PCR증폭을 실시한 다음, 각각의 증폭산물을 1.5% agarose gel에 전기영동하여 웅성 특이적 DNA band의 증폭여부를 확인하였다. SRY 유전자에서 웅성개체 쇠고기는 1,348 bp 크기의 단편을 가진 DNA band가 검출되었으나, 자성개체의 경우 DNA band가 전혀 검출되지 않은 것을 확인 할 수 있었다. 또한, ZFY 유전자에서 웅성개체의 쇠고기는 979 bp 크기의 단편을 가진 DNA band가 모두 검출되었으나, 자성개체의 쇠고기에서는 역시 DNA band가 전혀 검출되지 않았다. 즉, SRY 및 ZFY 유전자는 모두 숫소에서 유래한 쇠고기에서 웅성 특이적인 DNA band가 정확히 검출된 반면 암소에서 유래한 쇠고기에서는 웅성 특이적 DNA band가 전혀 검출되지 않았다. 또한 쇠고기 성 감별법을 도축 후 가공 유통판매단계에 실제 활용 가능성을 검증하고자 시중에 유통되고 있는 등심 및 갈비 포장육 350시료를 무작위 추출하여 성 판별을 실시한 결과 숫소가 252시료(72%) 그리고 암소가 98두(28%)로 조사되었다. 따라서 본 연구에서 개발한 SRY 또는 ZFY의 웅성 특이적 성 결정 유전자를 이용하는 쇠고기 성 감별기술은 생산단계는 물론 도축 후 가공 유통 판매되고 있는 모든 쇠고기의 암수 성감별을 위한 유용한 DNA 표지인자로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

• 대한수의학회지
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• 제41권2호
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• pp.157-165
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• 2001

Amplified fragment length polymorphism(AFLP) technique is based on the polymorphism detection through selective PCR amplification of restriction fragments from digested genomic DNA and thus includes the procedures of the total DNA digestion by endonucleases, ligation of adapters to the ends of the fragments, and following the selective amplification of the restricted DNA fragments. This study were aimed to : (1) determine the genetic variability of S aureus strains, (2) estimate genetic diversity within and among these strains, (3) compare phylogenetic relationships among these strains as genetic markers using AFLP techniques. Genomic DNA was digested with a particular combination of three restriction enzymes with specific recognition sites and the DNA fragments were ligated to restriction specific adapters and amplified using the selective primer combinations. In the S aureus strain, the number of scorable AFLP bands detected per each primer combination varied from 29 to 102, with an average of 61.59 using 27 primer combinations. A total of 1,663 markers were generated, 904 bands of which were polymorphic, showing a 33.48% level of polymorphism with these primer combinations. Among the primer combinations, E02/T02, E02/T03, E04/H02, E02/T01 and E04/H03 primer combinations showed a high level of polymorphism with 0.78, 0.76, 0.74, 0.71 and 0.70, respectively. But T03/H01, E01/T02 and E01/T03 primer combinations showed a low level of polymorphism with 0.38, 0.37 and 0.15, respectively, Therefore, the former primer combinations will be the most effective for AFLP analysis of S aureus. In SA1 sub-types the level of polymorphism of S aureus KCTC 1927 was similar to that of S aureus CU 01(0.825) and higher than those of other strains such as S aureus CU 02 (0.715), S aureus KCTC 2199(0.625), S aureus KCTC 1916(0.607) and S aureus KCTC 1621 (0.553). In SA2 sub-types the level of polymorphism of S aureus CU 07 was similar to that of S aureus CU 08(0.935) and higher than those of both S aureus CU 04(0.883) and S aureus CU 05(0.883) and lower than those of S aureus CU 03(0.583). In SA3 subtypes the level of polymorphism of S aureus CU 11 was similar to that of S aureus CU 12(0.913) and lower than that of S aureus CU 15(0.623). The results proved that AFLP marker analysis of S aureus strain could be used to study the epidemiology of mastitis and in addition, common genotype in geographic region could be useful for the development of an effective vaccine or DNA marker for easy diagnosis of mastitis caused by S aureus infection.

• Journal of Dairy Science and Biotechnology
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• 제31권2호
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• pp.127-131
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• 2013

The aim of this study was to investigate adulteration of caprine milk products by bovine milk using biomolecular techniques with bovine-specific primers for the mitochondrial cytochrome b gene. Polymerase chain reaction (PCR) and real-time PCR assays were applied to caprine milk products including infant formula, city milk, and fermented milk. The results indicated that six out of the eight caprine infant formula products tested contained bovine milk components. In addition, two of the three tested caprine city milk products and two caprine fermented milk products were shown to be adulterated with bovine milk. Conventional PCR results corroborated with results obtained by real-time PCR. This study demonstrates that DNA-based species identification procedures would be useful and applicable in routine examinations of the dairy industry to ensure the quality and safety of dairy foods.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제20권6호
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• pp.866-871
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• 2007

Testis-specific protein (TSPY) is a Y-specific gene, with up to 200 copy numbers in bulls. In order to make bovine embryo sexing under farm condition more feasible, the possibility of using a non-electrophoretic method to detect the TSPY gene for sexing bovine early embryos was examined. Primers were designed to amplify a portion of the TSPY gene and a common gene as an internal control primer. PCR optimization was carried out using a DNA template from bovine whole blood. Furthermore, embryo samples were diagnosed by this method and the sexing results were contrasted with those of the Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) method. The results showed that TSPY was as reliable a sexing method as LAMP. Forty-three morula and blastocyst embryos collected from superovulated donor dairy cattle were sexed by this method, and twenty-one embryos judged to be female embryos were transferred non-surgically to recipients 6 to 8 days after natural estrus. Out of 21 recipients, 9 were pregnant (42.86%) and all delivered female calves. The results showed that the sex predicted by this protocol was 100% accurate. In conclusion, the TSPY gene was a good male specific marker and indicated that a non-electrophoretic method was feasible and accurate to detect the TSPY gene for sexing preimplantation bovine embryos.

• 대한수의학회지
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• 제45권2호
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• pp.199-205
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• 2005

DNA fingerprint patterns of 8 Brucella reference strains and 15 B. abortus field isolates were characterized by repetitive element sequence-based PCR (rep-PCR) using BOX- and ERIC-primers in this study. AMOS PCR differentiated all Brucella field isolates from B. abortus RB51, a vaccine strain by producing a B. abortus-specific 498 bp band. Rep-PCR using BOX-primer produced 13 to 18 bands with sizes of between 230 and 3,300 bp, and discriminated Brucella strains to the species level except B. canis and B. suis. PCR products amplified with ERIC primers were, however, not appropriate for differentiating the Brucella isolates. DNA fingerprint patterns for all B. abortus field isolates were identical among them and were put on one cluster with B. abortus biovar 1 reference strain in the dendrogram, indicating they were highly clonal. These results suggested that rep-PCR using BOX primer might to be a useful tool for calculating genetic relatedness among the Brucella species and for the study of brucellosis epidemiology.

• 한국축산식품학회:학술대회논문집
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• 한국축산식품학회 2000년도 국제심포지엄 및 제26차 추계학술발표회
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• pp.59-75
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• 2000

본 연구는 한우고기를 수입육 및 젖소고기 등의 쇠고기를 판별할 수 있는 DNA marker를 개발 하기 위하여 수행하였다. 첫 번째 실험으로 RAPD 기법을 이용한 종 특이 marker 개발 및 이 marker의 SCAR marker로의 개발을 목표로 수행되었다. Random primer 300개에 대하여 PCR 수행하여 품종 특이적인 양상을 나타내는 14개 primer를 선별하였고 그 중 MG-3, MG-6, MG-12의 primer는 각각 0.9 kb, 1.0 kb, 2.0kb의 위치에서 홀스테인, 한우,헤어포드 특이적인 RAPD 단편을 나타내었다. 이들 단편들 중 한우 특이적인 단편을 클로닝한 후 random primer가 포함된 부분의 염기서열을 결정하였다. 10bp의 RAPD random primer에 10 bp의 염기를 추가하여 SCAR primer를 제작하였다. SCAR marker의 PCR수행 결과, RAPD marker와 같은 1.0 kb의 크기에서 한우에서만 특이적으로 하나의 밴드로 증폭이 되었다. 이러한 결과는 젖소 DNA와의 비교실험에서와 같이 Holstein에서는 나타나지 않으면서 한우에서만 단일밴드가 증폭되어 한우와 젖소의 판별에 이용이 가능할 것으로 판단된다. 두 번째 실험으로 포유동물의 모색과 연관된 MC1R 유전자 변이와 소 품종간의 유전자형 빈도를 파악하고 한우와 흑모를 가진 홀스테이나 앵거스와의 판별 가능한 DNA marker로서의 이용성을 알아보기를 위하여 수행하였다. MC1R 유전자의 변이부분을 증폭시킬 수 있는 한쌍의 primer를 제작하여 350 bp 크기의 PCR 산물를 얻어 제한효소 BsrF I 과 MspA1 I 으로 각각 절단한 후 2.5%의 Metaphore agarose gel에 전기영동하여 유전자형을 결정하였다. 소 품종별 유전자형 빈도를 분석한 결과 한우에서는 $E^+e$와 ee 유전자형이 각각 0.10과 0.90로 나타난 반면 젖소(홀스테인)에서는 유전자형 $E^DE^D,\;E^DE^+$ 및 $E^De$가 각각 0.86, 0.00 및 0.14, 앵거스에서는 각각 0.57, 0.26 및 0.17의 빈도를 보여 젖소와 앵거스 두 품종 모든 개체가 대립유전자 $E^D$를 가지고 있어 한우와는 분명한 차이를 보였다. 그러나 수입육의 경우 분석시료 43%만이 $E^D$를 가지고 있었다. 따라서 MC1R 유전자의 유전자형을 PCR-RFLP 방법을 이용한다면 현재 젖소고기가 한우고기로 둔갑 판매되는 부정유통을 방지할 수 있는 하나의 DNA 지표인자로서 활용될 수 있을 것으로 판단되었다. 결론적으로 본 연구에서 개발한 한우 특이 SCAR marker와 MC1R 유전자를 이용한다면 국내에서 사육하고 있는 젖소고기가 한우고기로 둔갑 판매되는 부정유통사례를 근접할 수 있는 방법이 될 것으로 판단되나 다양한 품종이 교잡된 수입쇠고기와의 판별기술 개발을 위해서는 보다 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.

• 대한의생명과학회지
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• 제6권1호
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• pp.65-72
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• 2000

반추수에서 발생하는 Johne병의 조기 진단 방법을 제시하고 이 질병의 원인체와 미생물학적 특징 이 유사한 M. bovis, M. avium 등의 mycobacteria 감염증을 감별 진단하는 방법 을 개발하기 위하여 Mycobacterium 균속의 표준균주를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 확립하였다. Johne병으로 의심되는 소의 혈액과 유즙을 채취하여 분리한 단핵구 및 거식세포로부터 genomic DNA를 추출하였다. 각 시료로부터 추출한 DNA를 template로 이용하여 Mycobacterium spp.에 특이적인 16S rDNA primer set를 이용한 PCR을 수행하여 시료내의 mycobacterial DNA 보유 여부를 확인하였다. 한편 mycobacteria 양성으로 확인된 시료는 M. avium complex 균종에 특이한 16S rDNA 염기서열을 기초로 하여 제작한 primer set와 M. paratuberculosis의 IS900 sequence에 특이한 primer set를 이용하여 duplex PCR을 수행하여 Johne병 원인체의 보균 여부를 조사하였으며, 이 결과를 oligonucleotide probe를 사용한 Southern blot hybridization을 통하여 다시 확인하였다. 이와 같은 duplex PCR기법을 실제 축산 현장에서 수집한 유즙과 말초혈액으로부터 분리한 단핵구 및 거식세포 시료에 적용한 결과 본 연구에서 확립한 duplex PCR기법 유용성을 확인할 수 있었다.