LIM, YOUNG-YI;EUN-HA PARK;JI-HYE KIM;SEUNG-MOON PARK;HYO-SANG JANG;YOUN-JE PARK;SEWANG YOON;MOON-SIK YANG;DAE-HYUK KIM
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제11권6호
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pp.915-921
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2001
Phytase improves the bioavailability of phytate phosphorus in plant foods to humans and animals, and reduces the phosphorus pollution of animal waste. In order to express a high level of fungal phytase in Saccharomyces cerevisiae, various expression vectors were constructed with different combinations of promoters, translation enhancers, signal peptides, and terminator. Three different promoters fused to the phytase gene (phyA) from Aspergillus niger were tested: a galactokinase (GAL1) promoter, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GPD) promoter, and yeast hybrid ADH2-GPD promoter consisting of alcohol dehydrogenase II (ADH2) and a GPD promoter. The signal peptides of phytase, glucose oxidase (GO), and rice amylase 1A(RAmy1A) were included. Plus, the translation enhancers of the ${\Omega}$ sequence and UTR70 from the tobacco mosaic virus (TMV) and spinach, respectively, were also tested. Among the recombinant vectors, pGphyA06 containing the GPD promoter, the ${\Omega}$ sequence, RAmy1A, and GAL7 terminator expressed the highest phytase activity in a culture filtrate, which was estimated at 20 IU/ml. An intracellular localization of the expressed phytase activity in a culture filtrate, which was estimated at 20 IU/ml. An intracellular localization of the expressed phytase was also performed by inserting an endoplasmic reticulum (ER) retention signal, KDEL sequence, into the C-terminus of the phytase within the vector pHphyA-6. It appeared that the KDEL sequence directed most of the early expression of phytase into the intracellular compartment yet more than $60\%$ of the total phytase activity was still retained within the cell even after the prolonged (>3 days) incubation of the transformant. However, the intracellular enzyme activity of the transformant without a KDEL sequence was as high as that of the extracellular one, thereby strongly suggesting that the secretion of phytase in S. cerevisiae appeared to be the rate-limiting step for the expression of a large amount of extracellular recombinant phytase, when compared with other yeasts.
샤르도네 품종을 이용한 포도주 양조용 효모의 발효 특성은 다음과 같다. S6U 균주는 다른 균주에 발효속도는 느렸지만 발효 종료시점에 완전히 발효되는 특징을 보였다. W-3 균주는 발효중 산 생성량이 적었으며 (0.75%), UCD530과 AC- 균주로 발효된 포도주에는 산류 extract 함량이 각각 3.26 mg/L 및 3.22 mg/L로써 다른 균주에 비해 많았다. CEG와 CS2 균주로 발효된 포도주는 특히 황색도 값이 높았으며, EC1118 균주는 다른 와인 효모에 비해 아세트알데하이드(49.9 mg/L)을 많이 생성하였다. 효모의 알콜 내성 특성을 나타내는 methylene blue dyeing ratio에 있어서, EC1118 및 CY3079 균주는 약 15% 미만의 낮은 methylene blue dyeing ratio을 나타내어 이 두 균주가 다른균주에 비해 높은 알콜 내성이 있음을 보여주었다. 글리세롤 함량에 있어서 UCD530 균주는 다른 균주에 비해 극히 많은 생성능을 보였고 또한 succinic acid 및 lactic acid 생성량도 높아 전형적인 S. bayanus 특징을 나타내었다. 포도주의 Acetic acid 함량에 있어서 UCD530, EC1118, AC-, CY3079, W-3 균주로 발효된 것은 170 mg/L 이하로 비교적 낮았으며 S6U, CEG, CS2로 발효된 포도주는 350 mg/L 정도로서 높았다.
현재 우리나라에서 재배되고 있는 품종중(品種中)에서 포도주생산에 가장 적합한 품종(品種)을 선택하기 위하여 품종별(品種別)로 성숙기간(成熟期間)의 성분변화(成分變化), 포도의 성분(成分) 분석(分析), 시험발효(試驗醱酵)로 얻은 포도주의 분석(分析) 및 관능검사(官能檢査)를 통하여 얻은 결과와 포도에 자연적(自然約)으로 존재(存在)하는 효모(酵母)를 분리(分離), 동정(同定)하고 선정(選定)된 균주(菌株)의 특성(特性)을 실험(實驗)한 결과는 다음과 같다. 1. 모든 품종(品種)에서 양조용(釀造用) 포도의 수확은 일반적 수확기보다 2주 늦게하여 당함량(糖含量)의 현저한 증가를 보였다. 2. 포도의 성분(成分) 분석(分析) 결과, Muscat Bailey A는 당함량(糖含量)이 가장 높아서 자연발효(自然醱酵)시켜 포도주를 양조(釀造)할 수 있고. Campbell Early, Steuben, Alden은 Chaptalisation이나 다른 방법으로 당함량(糖含量)을 높여 포도주생산(生産)에 이용할 수 있다. 3. 시험발효(試驗醱酵)로 얻은 포도주의 $KMnO_4$계수(係數)는 전체적으로 外國産(외국산) 포도주에 비하여 매우 낮았으며 또한 methanol 함량(含量)도 낮아서 모두 70ppm 이하였다. 4. 관능검사(官能檢査)를 통하여 pink wine이 적(赤)포도주보다 양호(良好)하며 hybrid 포도로부터 오는 포도주의Foxy taste는 우리나라 사람에게는 불쾌감을 주지 않는다는 결론을 얻었다. 5. Muscat Bailey A는 당함량(糖含量)이 높은 점과 향기 및 일반성분(一般成分)으로 보아서 산도(酸度)조절을 하면 가장 우수한 양조용(釀造用) 품종(品種)이 될 수 있다. 6. 선정(選定)된 6주(株)는 Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces capensis, Saccaromyces globosus로 동정(同定)되었으며 alcohol 및 휘발산(揮發酸) 생성(生成)을 측정(測定), 비교한 결과 이중 No. 3과 No. 4 strain이 가장 우수하였다.
박테리오신의 항균활성 개선을 위해 선행연구에서 개발된 ADH 프로모터에 의해 박테리오신 유전자를 발현시키는 효모발현 벡터에 GPD 프로모터 단편을 도입하여 강력한 프로모터를 가진 효모발현 재조합 플라스미드DNA를 제작하였다. ADH 프로모터에 의해 박테리오신 유전자를 발현시키는 기존의 형질전환 효모들에 비해 새롭게 개발된 GPD 프로모터에 의해 박테리오신 유전자를 발현시키는 형질전환 효모들이 그람양성 대표세균인 고초균(B. subtilis)과 그람음성 장내세균인 대장균(E. coli) 모두에서 보다 높은 생육억제환을 나타내는 것을 확인 하였다. 이 연구의 결과로 GPD 프로모터에 의해 발현이 유도되는 박테리오신 생산 효모들을 이용하여 부패하기 쉬운 식품들의 보존성을 향상시키기 위한 보존제 대체물질 또는 가축 사료에서 병원균의 생육을 저해하기 위한 항생제 대체물질의 산업적인 생산이 가능하게 될 것으로 기대된다.
딸기를 이용한 건강막걸리를 개발하고자, 딸기를 첨가하여 막걸리를 제조한 후 이들의 품질 특성을 조사하였다. 먼저 딸기막걸리 제조에 적합한 효모를 선발하기 위해 시판 알코올 발효효모와 배재대학교에서 분리 보관중인 알코올 발효효모를 이용하여 딸기막걸리를 제조한 결과 분리 효모인 Saccharomyces cerevisiae JSK104가 발효 7일째에 17.4%의 에탄올 생성하여 우수효모로 선발되었고, 최적 첨가량은 5%이었다. 멥쌀과 생딸기, 입국, S. cerevisiae JSK104을 사용하여 딸기막걸리 발효 중 이화학적 성질, 효모와 유산균 생균수 및 항고혈압성 안지오텐신 전환효소(ACE) 저해활성 변화를 조사하였다. pH는 발효기간이 경과함에 따라서 발효 1일 째, pH 4.01에서 pH 3.61까지 낮아지는 경향이었고 총산 함량은 증가하였다. 에탄올 함량은 발효 7일째 약 17%를 생성하여 최고에 달하였고, 효모와 유산균수는 발효 1일에 최고에 도달한 후 일정한 수를 유지하였다. 항고혈압성 안지오텐신 전환효소 활성은 발효 5일에 최고치에 도달한 후 큰 변화가 없었다.
국산 캠벨 얼리 포도과즙을 36 $^{\circ}Brix$로 동결농축한 후 국산 포도로부터 분리된S. cerevisiae S13, D8 균주를 이용하여 아이스와인의 발효를 행하면서 대조균주인 S. cerevisiae Fermivin과 발효특성을 비교하였다. 발효 중 S13과 D8의 경우 Fermivin보다 당도가 다소 빠르게 감소하였으며 빠른 알코올 생성을 보였다. 발효 종료 시점인 9일 후의 알코올 농도는 D8이 15.2%, S13은 14.0%, Fermivin은 12.6%를 나타내었다. 잔존 환원당의 함량은 Fermivin 포도주가 14.0%로 가장 높았으며 D8 포도주는 9.07%, S13 포도 주는 9.77%로 나타났다. 총산 함량은 Fermivin 포도주 약 0.82%에 비하여 D8과 S13 포도주에서 각각 0.97, 0.96%로 다소 높게 나타났으며 pH는 모든 포도주에서 3.65-3.67로 유의적인 차이가 없었다. 아세트알데히드는 D8 포도주가 81.9 ppm으로 다소 높았으며 Fermivin 포도주는 58.8 ppm으로 가장 낮았다. 메탄올 함량은 S13, D8 포도주가 Fermivin 포도주보다 다소 높았으나 과실주의 메탄올 허용 기준치보다는 매우 낮았다. L 값은 6.89-6.99로 일반포도주에 비해 매우 낮게, b 값은 4.37-4.54로 매우 높게 나타났다. 아이스와인의 향과 맛은 S13 포도주가 가장 높은 점수를 받았으며 전반적인 기호도는 D8와 S13 포도주가 Fermivin 포도주보다 높은 점수를 받았다.
원형질체 융합을 통하여 killer 효모의 유전형질을 기존의 ethanol 발효효묘에 도입하므로서 야생의 killer 효모에 저항성을 가지고, 오염효모를 치사시킬 수 있으며, ethanol 발효능도 유지하는 새로운 효모균주를 개발하였다. 먼저 융합주의 생리적인 특성을 검토한 바, 융합주는 양천주에 비하여 세 적이 크고, DNA 함량이 높았으며, 증식도는 친주와 유사한 경향이었다. 또 융합주를 최소배지에서 보존하는 것이 안정성을 높이는 방법이었고, 7일 간격으로 7회 계대배양하므로서 유전적으로 안정화시킨 융합주를 6개월 간 계속 사용한 결과 segregant가 전혀 나타나지 않았으므로 매우 안정하였다. 또한 융합주는 핵 및 포자를 형성함을 관찰 할 수 있었고, TTC 정색반응에서 적색 및 pink 색을 띄었으며, 탄소원의 자화성 및 발효능은 천주와 유사하였는데, KCI, NaCl, sodium propionate alc cycloheximide 등에 대한 내성도 양친주의 한쪽을 따랐다. 그리고, 융합주를 20% glucose와 sucrose에서 72시간 및 60시간 배양했을 때, FWKS 260의 경우 각각 9.6v/v% 및 9.8v/v%의 ethanol을 생성하였고, 감수성주와 혼합배양한 결과 FWKS260의 경우 48시간 이후에는 감수성주를 거의 발견할 수 없었으며, 전주 및 융합주의 dsRNA plasmid를 추출하여 전기 2.5kb의 L 및 M dsRNA plasmidsms는 서로 연관성이 있으며, killer toxin 분비 및 저항성을 나타내는 유전자를 지배하는 것은 M dsRNA plasmid임을 확인할 수 있었다. 수 있었다.
국내산 참다래 와인의 고품질화 방안으로 제주도에서 육성된 참다래 품종인 제시골드와 제시스위트를 대상으로 참다래 와인 제조에 적합한 2종의 효모를 이용하여 저온 발효 숙성한 참다래 와인의 품질 특성을 비교 분석하였다. 총산도는 발효 초기에 제시스위트와 제시골드가 각각 0.94%와 1.22%였으나 발효가 진행됨에 따라 조금씩 증가하여 발효 6일에는 각각 1.49%와 1.26%로 가장 높은 값을 나타내었으며 균주별로는 차이가 없었다. 에탄올 함량은 발효 4일부터 급격히 증가하였으며 발효 12일에는 제시스위트의 S. bayanus Lalvin 발효액이 10.2%로 가장 높은 함량을 나타내었고, 제시스위트의 S. cerevisiae Fermivin 발효액이 9.2%, 제시골드의 Lalvin과 Fermivin 발효액이 각각 9.4%와 9.4%였다. 가용성 고형분 함량은 참다래 품종과 효모 종류에 관계없이 비슷한 변화를 보였는데, 발효 초기에 약$24.8^{\circ}Brix$로 발효가 진행됨에 따라 서서히 감소하였으며 발효 6일 후에 약 $9.7^{\circ}Brix$로 가장 낮은 값을 나타내었다. 총페놀 함량은 발효 시작 전에 제시스위트(1,127 mg/L)가 제시골드(848 mg/L)보다 1.32배 높았으며, 발효기간 동안에는 발효 6일 후 급격히 감소하였다가 발효 12일까지 다소 증가하는 경향을 나타내었다. 숙성기간 동안에도 숙성 30일 후 증가하였다가 숙성 120일까지 거의 일정한 값을 유지하였다. 본 연구 결과 효모 종류에 따른 참다래 와인의 품질 특성은 다소 유사한 경향을 보였으나 참다래 품종별로는 차이를 보였으며, 에탄올 함량과 총페놀 함량에 있어서 제시스위트 품종으로 발효한 와인의 품질이 우수하였다.
공업적으로 간장을 담금하여 발효숙성시킬때 Saccharomyces rouxii $T_9$을 배양하여 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우 발효덧중의 효모의 동태와 성분의 소장에 대하여 조사한 결과는 다음과 같다. (1) 효모첨가구의 간장덧 1ml중에 존재하는 내염성효모수는 담금 1개월 경과후에 $185{\times}10^3$개였으며 담금 4개월 경과후에 $750{\times}10^3$개로 나타난데 비하여 효모무첨가구의 내염성효모수는 담금 1개월경과후에 $98{\times}10^3$개였으며 담금 4개월 경과후에 $394{\times}10^3$개로서 효모첨가구의 경우 무첨가구의 약 2배로 나타났다. (2) 효모첨가구는 담금 $5{\sim}6$개월덧 1ml중에 TTC red군의 일반효모수가 $2132{\times}10^3{\sim}3252{\times}10^3$개로 나타난데 비하여 효모무첨가구는 $752{\times}10^3{\sim}1251{\times}10^3$개로서 현저한 차이를 보였으면 red pink군과 pink군의 효모도 무첨가구에 비하여 첨가구에서 더 많이 나타났다. (3) 효모첨가구나 무첨가구공히 담금 1개월 경과후부터 6개월까지 TTC red군의 효모가 우세하게 나타났다. (4) 간장덧즙액중의 총질소, pH, 순고형물, 완충능동은 효모첨가구와 무첨가구간의 큰차가 없었으나 Alcohol과 색도는 효모첨가구가 월등히 높았으며 유리환원당은 효모무첨가구가 높았다. (5) 관능시험한 결과 효모첨가구와 무첨가구간의 맛의 양부차는 뚜렷하지 않었으나 외관및 향기의 면에서 효모첨가구가 월등히 우수 하였다.
본 연구에서는 상온 저장이 가능하며 별도의 처리 없이 바로 섭취할 수 있는 통초당옥수수를 위한 최적 살균법을 도출하고 저장기간동안 최적 살균된 초당옥수수의 품질인자를 분석하였다. 살균 시 유통기한 확보 및 초당옥수수의 고유한 특징인 아삭한 식감이 가열처리에 의하여 감소되는 것을 최소화 하기 위해 비가열 전처리 공정으로서 알코올 세척을 도입하였으며, 냉점은 초당옥수수의 속대와 중심 사이로 하였다. 초당옥수수의 표면은 알코올 세척을 통하여 1 log CFU/g 이상을 감소시킨 후 $F_{121.1}=4$분을를 만족하도록 가열하여 $25^{\circ}C$ 인큐베이터에서 9개월간 저장하면서 대조군으로서 일반적인 증숙의 방법으로 가열한 초당옥수수의 품질과 비교하였다. 알코올 처리 및 가열 살균한 초당 옥수수의 조직감은 대조군의 조직감 대비 30%이내를 유지하여 최소 $464.50{\pm}103.35g$에서 최대 $514.50{\pm}81.83g$값을 나타내었으며, 당도는 샘플 간의 차이가 다소 있었으나 최소 $28.83{\pm}1.05%$에서 최대 $34.36{\pm}0.42%$값으로 대조군에 대비하여 30% 이내 당도를 유지하였다. 초당 옥수수 겉표면 황색도는 대조군 대비 5% 이상 향상되어 최대 $34.36{\pm}0.42$값을 나타내었으며, 미생물 검사에서는 일반세균과 진균류가 저장 9개월 동안 검출되지 않았다. 이러한 연구결과는 가열살균한 초당옥수수의 품질변화가 최소화되면서 6개월 이상의 상온유통이 가능한 최적 살균 방법을 도출하였으며, 이에 따라 가열에 의하여 식품 본연의 조직감 감소를 최소화하면서 상온유통이 가능한 살균제품에 이용될 수 있다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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