• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2003년도 생물공학의 동향(XII)
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• pp.34-38
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• 2003

For the production of $B^{30}-homoserine$ insulin analog as a novel anti-diabetic drug, the fermentative study was attempted for the maximal gene expression of HTS-fused $B^{30}-homoserine$ insulin precursor in the recombinant Escherichia coli cells. In a batch fermentation, the maximal production of insulin precursor as much as 38.95 mg/L-h, which occupied more than 12.8% of total cell protein. was achieved when the gene expression was induced by 0.5 mM IPTG at the middle logarithmic growth phase. The HTS-fused $B^{30}-homoserine$ insulin precursor was recovered from a batch culture through the processes of cell harvest, collection of insoluble fraction after sonication and purification by nickel affinity column chromatography. The isolated insulin precursor was 14 mg/L with a recovery yield of 35.9% of expressed gene product. The insulin A and B chain mixture was recovered after the insulin precursor was subjected to CNBr cleavage and purified by nickel affinity column chromatography. The isolated insulin chains were then sulfitolyzed with sodium thiosulfat and sodium tetrathionate, and reconstituted to insulin analog with ${\beta}-mercaptoethanol$, followed by purification with CM-Sepharose C-25 column chromatography.

• 대한의생명과학회지
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• 제4권1호
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• pp.35-42
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• 1998

치료목적으로 채취한 사람 복수에서 C반응성 단백질 (CRP)을 분리 정제하여 사람 대식세포 탐식활성에 미치는 영향에 대하여 연구하였다. CRP는 p-diazonium phenyl-phosphoryl choline 혹은 C-polysaccharide coupled sepharose 4B와 hydroxylapatite affinity chromatography법으로 분리 정제 시켰다. 대식 세포는 ficoll hypaque 밀도 원심 구배법으로 분리시킨 다음 부착법으로 정제시키고 탐식 시험을 이용하여 확인하였다. CRP가 대식 세포의 시험 관내 미생물 탐식 활성에 미치는 영향은 촉진 혹은 억제시키는 경향을 보였다. 즉, CRP와 대식세포 미생물 탐식능과의 관계는 반응시킨 시간, 반응계에 가해준 CRP량, 미생물ㆍ탐식세포 및 CRP상호간 반응시킨 순서에 따라서 다르게 나타났다. 대식세포의 시험관내 탐식활성에 미치는 CRP 자극의 특성은 한계자극 특성을 보였다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제36권4호
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• pp.255-259
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• 1993

키틴 분해 효소활성이 높은 균주로 분리동정한 Aeromonas salmonicida YA7-625의 chitobiase를 ammonium sulfate침전, affinity adsorption, DEAE-cellulose chromatography, hydroxylapatite chromatography, gel filtration 과정을 통해 수율 47.2% 및 정제도 31.5로 분리, 정제 하였다. 정제된 chitobiase는 pH6.0, $40^{\circ}C$에서 최대의 활성을 나타내었고 분자량은 15,000 daltons로 추정되었다. 금속이온과 저해제들의 효과를 검토결과 효소의 활성에는 cystein, glutamic acid, aspartic acid, serine, tryptophan 및 tyrposine 잔기 등이 관여하는 것으로 유추되었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제14권2호
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• pp.344-349
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• 2004

A gene encoding inulin-degrading enzyme of Bacillus sp. snu-7 with ORF of 1536 nucleotides was cloned. And it was overexpressed as His-tagged protein in E. coli BL21(DE3) pLysS using pRSET B vector containing mature enzyme sequence. Maximum enzyme production was achieved by IPTG (0.1 mM) induction at $OD_{600}$ 1.2 and $30^{\circ}C$ followed by 6 h incubation. The expressed protein purified through immobilized metal affinity chromatography showed molecular mass of 60 kDa on SDS-PAGE. Results of thin-layer chromatography using inulin as a substrate showed the enzyme to be an exotype inulinase capable of producing only monomeric fructose as a product. $K_m$ and $k_{cat}$, for the hydrolyses of inulin and sucrose were $2.28\pm0.08$ mM and 358.05$\pm$20.38 $min^{-l}$, and 22.02$\pm$0.41 mM and 4619.11$\pm$215.12 $$min^{-1}, respectively. Optimal activity of the exoinulinase occurred at pH 7.0 and $50^{\circ}C$.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제27권5호
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• pp.983-989
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• 2017

NADPH-P450 reductase (NPR) transfers electrons from NADPH to cytochrome P450 and heme oxygenase enzymes to support their catalytic activities. This protein is localized within the endoplasmic reticulum membrane and utilizes FMN, FAD, and NADPH as cofactors. Although NPR is essential toward enabling the biochemical and pharmacological analyses of P450 enzymes, its production as a recombinant purified protein requires a series of tedious efforts and a high cost due to the use of $NADP^+$ in the affinity chromatography process. In the present study, the rat NPR clone containing a $6{\times}$ Histidine-tag (NPR-His) was constructed and heterologously expressed. The NPR-His protein was purified using $Ni^{2+}$-affinity chromatography, and its functional features were characterized. A single band at 78 kDa was observed from SDS-PAGE and the purified protein displayed a maximum absorbance at 455 nm, indicating the presence of an oxidized flavin cofactor. Cytochrome c and nitroblue tetrazolium were reduced by purified NPR-His in an NADPH-dependent manner. The purified NPR-His successfully supported the catalytic activities of human P450 1A2 and 2A6 and fungal CYP52A21, yielding results similar to those obtained using conventional purified rat reductase. This study will facilitate the use of recombinant NPR-His protein in the various fields of P450 research.

• 대한화학회지
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• 제23권3호
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• pp.165-174
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• 1979

토양중에서 분리한 Penicillium속이 생산하는 글루코오스 옥시타아제를 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하고, 이 효소의 특성을 알아보았다. D-Gluconyl-${\omega}$-aminohexyl Sepharose컬럼을 사용하여 친화성 크로마토그래피를 행한 결과 14.6배 정제되었고 수율은 79%였으나 카탈라아제가 소량 함유되어 있어서 Sepharose 6B 겔 여과를 행하여 이를 제거하였다. 이 결과 27.2배 정제되고 수율이 74.1%인 정제효소를 얻었으며 7% polyacrylamide 겔 전기영동 결과 단일대를 보여주었고 비활성도는 단백질 mg당 90.83U였다. 정제된 효소의 흡광스펙트럼과 기질에 대한 특이성을 조사하였으며 최적 pH는 5.6∼6.0, 최적온도는 $40^{\circ}C$, D-글루코오스에 대한 $K_m$값은 $8.5{\times}10^{-3}M$, 활성화에너지는 3.43 kcal/mole이었다.

• 미생물학회지
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• 제38권4호
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• pp.241-246
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• 2002

Bacillus circulans의 endo-$\beta$-1,3-1,4-glucanase유전자를 발현 vector pQE30에 삽입시키고 E. coli Ml5에서 발현시켜 효소를 생산.정제하였다. 생산된 endo-$\beta$-1,3-1,4-glucanase는 nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) metal-affinity chromatography 과정을 거쳐 단일 단백질로 정제되었다. 정제된 효소의 분자량은 SDS-PAGE 전기영동법으로는 28 kDa이었다. 효소 최적 활성 pH와 온도는 각각 pH 6.8과 $60^{\circ}C$였다. 이 효소는 pH 5.5～7.5와$55^{\circ}C$ 이하의 온도에서 안정하였다. 또한 본 효소는 여러 가지 금속 이온에 의해 대부분의 활성이 억제되었고, 특히 $Hg^{2+}$에서는 강하게 효소 활성이 저해됨을 보였다. 유기 용매에 대한 활성은 10%의 methanol이나 ethanol, isopropanol, 1-butanol 에 대하여 모두 낮은 활성을 나타내었다.

• 한국동물학회지
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• 제32권4호
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• pp.420-428
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• 1989

Pseudogobio esocinus의 심장, 신장 및 간 조직은 하부단위체 C를 함유하는 젖산수소이탈효소를 갖고 있음이 확인되었다. 하부단위체 A 및 B에 대한 유전자들의 조직 발현은 다른 포유동물의 것과 유사하였으며 분자량은 140,000 정도로 추정되었다. Oxamate gel을 사용한 chromatography결과 A4 동위효소는 NAD+보다는 column buffer에 의해 용출되었다. B4 동위효소는 CM-Sepharose column을 사용하여 부붙 정제되었다. B4 동위효소는 물론 A4 동위효소도 고농도의 Pyruvate에 의해 저해되었다. A4 동위효소의 affinity chromatography 상 행동과 Pyruvate 저해 정도로 보아 A4 등위효소는 B4 동위효소 두 역학적으로 유사하다고 사료된다. P. esainus A4 동위효소에 대한 항체는 mouse A4 등위효소와 반응하지만 동종의 B4 동위 효소와는 반응하지 않는 특성으로 보아 하부단위체 B는 진화과정에서 보존성이 낮은 것으로 사료된다. Three tissues of heart, kidney and liver of a primitive cvprinid Pseudogobio esocinus were found to have lactate dehydrogenase isozyme(5) containing subunit C. Tissue expressions of genes for subunits A and B were similar to those of mammalian species. Molecular weight of the isozymes were estimated to be 140,000 approximately. Affinity chromatography of the isozymes on the immobilized oxamate gel revealed that A4 isozyme was not elected in NAD+ but in column buffer. B4 isozune was isozpnatically purified by subjecting kidney extract to a CM-Sepharose column. Ae isozvme as well as B4 isozvme was inhibited by high concentrations of pyruvate. The affinity chromatographic behavior and susceptibility to pyruvate inhibition of the A4 isorpne suggest that A4 isozwne is similar to B4 isozyme kinetically. Antibodies against p. esocinus A4 isogyme reacted with mouse At isozyme but not with p. esocinus B4 isogyme, reflecting that subunit B is less conservative in its evolution.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제29권1호
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• pp.1-8
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• 1991

스파르가눔 생리식염수 추출액 내에 포함되어 있는 성분단백질 중 스파르가눔증 환자 혈청내 특이 IgG항체와 민감하고 특이하게 반응하는 항원단벼질인 36, 29 kDa단백질을 단세포군 항체를 이용한 면역친화성 크로마토그 래피로 순수분리할 수 있음은 이미 보고하였다. 이 연구에서는 스파르가눔 추출액 내에 포함된 이 36, 29 kDa단백질이 젤라틴을 고리로 한 친화성 크로마토그래피로 훨씬 쉽게 순수분리할 수 있음을 증명하고자 하였다. 젤라틴을 고리로 부착시킨 Sepharose 4B column에 스파르가눔 추출액을 통과시키고 젤라틴에 부착한 단백질은 4 M urea/0.1M NaCl 용액을 분리완충액으로 분리하였다. 이렇게 분리한 단백질은 SDS-PAGE에서 36, 29 kDa band로 구성되어 있었고, SDS-PAGE/immunoblot 결과 환자의 polyclonal 항체는 이들 band에만 반응하였다. 스파르가눔증, 기타 기생충증 환자 및 건강대조군 혈청내 스파르가눔 특이항체가(IgG)를 면역효소측정 법으로 측정 한 결과 순수분리한 이 단백질은 특히 특이도가 95.8%로 생리식염수 추출액의 89%보다 우수하였고 민감도는 차이가 없었다. 이상의 결과는 젤라틴을 고리로 이용한 친화성 크로마토그래피는 스파르가눔 생리식염수 추출액 내의 36 및 29 kDa 단백질을 간편하게 순수분리할 수 있고 단백질의 항원성도 유지할 수 있음을 보이고 있었다.

• 한국수산과학회지
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• 제33권1호
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• pp.55-59
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• 2000

무지개 송어의 뇌하수체 및 배양액에 존재하는 GTH II 농도를 측정하기 위해 Avidin- Biotin complex를 이용한 sandwich EIA 계을 개발했다. Protein A sepharose affinity chromatography을 통해서 얻어진 연어 GTH II의 rabbit IgG에 biotinylation시킨 것 (Biotin-salmon GTH II rabbit IgG)을 제2 항체로 사용하였고, Non-Biotin salmon GTH II rabbit IgG는 단지 protein A sepharose affinity chromatography에서 얻어진 IgG를 제 1 항체로 사용하였다. EIA는 sandwich법에 의해서 이루어졌으며, 효소반응 기질로는 TMB(3,3'5,5-tetramethylbenzidine)를 이용했으며, 반응후 450 nm의 흡광도에서 automatic microplate reader로 측정하였다. 그 결과, $0.12\;{\~}\;125\;ng/ml$의 범위에서 용량반응곡선을 얻었으며, 측정감도 (최소 검출량)는 거의 0.58 ng/ml 정도 였다. 그리고 뇌하수체 추출물 및 배양액 각각의 희석곡선은 GTH II 표존곡선과 일치 하였다. 또한 이러한 GTH II의 표준곡선는 뇌하수체내 다른 peptide hormone와는 교차반응을 거의 나타내지 않았다. Testosterone을 처리한 미성숙 무지개 송어의 뇌하수체 세포배양계를 이용하여 sGnRH에 의한 GTH II 분비량을 본 sandwich EIA계와 RIA계를 비교 조사한 결과, 거의 같은 분비량을 나타냈을 뿐만아니라 같은 분비 pattern을 나타냈다. 이러한 결과로부터 본 sandwich법 EIA계에 의해서 연어과 어류의 뇌하수체 추출물 및 뇌하수체 배양액 중의 GTH II 함량 및 분비량을 측정하는데 있어서 안정된 assay계라고 생각되어진다.